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【目的】 1. 运用建立的液相色谱质谱分析方法(LC-MS/MS)检测结直肠癌组织及癌旁组织RUNX3、MLH1、SFRP2和P15的基因甲基化水平，探讨基因甲基化与结直肠癌发生的关系。 2. 建立以PCR技术为基础，联合超高效液相（UPLC-UV）检测基因片段区域甲基化的分析方法，为基因甲基化分析提供更多方法选择。 【方法】 1. 样品收集保存及DNA提取纯化 收集广东医科大学附属医院胃肠外科10例手术切除且病理确诊为结直肠癌组织及癌旁组织标本，置 -80℃保存。培养结直肠癌HCT116细胞和小肠上皮细胞FHs74Int。利用试剂盒提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，酶标仪测定其浓度及纯度。 2. 引物设计 在NCBI网站上查找P16、RUNX3、MLH1等5个基因序列，利用MethPrimer在线软件对基因序列进行CpG岛分析，根据分析结果用Primer 5.0软件对基因进行引物设计，同时利用oligo 7.0软件分析引物质量，筛选出合适的引物。 3. DNA甲基化标准品的制备 以正常人外周血细胞DNA为模板，对目的片段P16外显子2进行非甲基化PCR 扩增，利用琼脂糖凝胶对扩增产物作纯化处理，并经亚硫酸盐处理后进行甲基化 PCR 扩增，即得的产物再经琼脂糖凝胶纯化回收后作为甲基化率 0.00%的DNA 甲基化标准品。通过亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR, BSP）对小肠上皮细胞FHs74Int和结直肠癌细胞HCT116进行测序，计算p16外显子2甲基化水平，将两种细胞的DNA进行亚硫酸盐处理和2次甲基化PCR，所得的产物经琼脂糖凝胶纯化后作为中和高甲基化率标准品。 4. 分析方法验证 通过建立的PCR-LC-MS/MS和PCR-UPLC-UV分析方法对胞嘧啶及腺嘌呤进行定性和定量分析，检测三个 DNA 低、中、高甲基化率标准品的甲基化率，并根据所得结果对标准曲线，和各个实验条件的进行验证，由此评估该分析方法的可靠性和准确性。 5. 样品甲基化分析 利用建立的方法分析结直肠癌肿瘤组织及癌旁组织RUNX3等4个基因甲基化水平。对提取纯化后的样品DNA，亚硫酸氢盐转化及2次甲基化PCR扩增，所得扩增产物经琼脂糖凝胶回收纯化，再经过88%甲酸裂解后并离心取上清液用LC-MS/MS进行分析。 【结果】 1. 通过亚硫酸盐处理，甲基化PCR成功扩增出RUNX3、MLH1、SFRP2和P15，并利用已建立了LC-MS/MS方法定量分析腺嘌呤和胞嘧啶。 2. 通过亚硫酸盐处理后的甲基化PCR成功制备了甲基化率为0.00%DNA甲基化标准品。通过通过亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR, BSP）对小肠上皮细FHs74Int和结直肠癌细胞HCT116进行测序检测，得到p16外显子2的甲基化水平分为47.34%和99.38%，并通过亚硫酸氢盐和甲基化PCR处理这两种细胞的DNA,得到的产物分别作为甲基化率为47.34%和99.38%的DNA甲基化标准品。利用LC-MS/MS测得小肠上皮细胞FHs74Int和人结直肠癌细胞HCT116的甲基化率分别为42.90%±1.74%（n=5），97.25%±2.99%（n=5）。由LC-MS/MS测得的数据与三种DNA甲基化标准品接近，该方法的可靠性从而得到了充分的验证。而利用UPLC-UV测得0.00%，小肠上皮细FHs74Int和结直肠癌细胞HCT116甲基化标准品的甲基化率分别为1.94%±5.92%（n=5），33.58%±3.42%（n=5），98.26%±2.69%（n=4）, 由于UPLC-UV测得的数据只与其中两种DNA甲基化标准品接近，该方法的可靠性有待完善。 3. 运用建立的LC-MS/MS分析方法对结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织RUNX3等4个基因片段甲基化水平进行检测，结果表明，RUNX3、MLH1、SFRP2和P15在肿瘤组织中的甲基化水平分别是26.93%±6.97%、13.95%±6.93%、26.60%±2.99%和6.50%±3.65%（n=10），在正常组织中的甲基化水平分别是13.79%±5.37%、13.87%±3.47%、22.30%±6.43%和6.06%±1.86%（n=10）。RUNX3 在肿瘤组织中的甲基化水平明显要高于癌旁组织，差异具有统计学意义。而MLH1、SFRP2、p15的甲基化水平在肿瘤组织和癌旁组织中差异没有统计学意义（P>0.05）。 【结论】 1. 验证和运用已建立的 PCR-LC-MS/MS 方法分析组织 RUNX3、MLH1、SFRP2和P15基因甲基化水平，结果显示结直肠癌组织RUNX3甲基化水平与癌旁组织的甲基化水平显著差异，差异具有统计学意义（P<0.01），提示组织RUNX3基因可作为CRC的潜在生物标志物。 2. 本实验设计P16外显子2合适的PCR引物，摸索与优化UPLC-UV分析腺嘌呤和胞嘧啶的条件，建立了亚硫酸氢盐-PCR-UPLC-UV 方法分析 P16 外显子2的基因甲基化水平的方法。通过分析3种DNA甲基化标准品的基因甲基化率，虽然该方法具有快速、适用性强等优点，但对甲基化定量分析仍然有待提高。