论文部分内容阅读
目的:探讨HPV16病毒引起新疆维吾尔族和汉族妇女宫颈癌的分子进化规律,分析新疆维吾尔族和汉族妇女宫颈癌HPV16全基因组基因多态性及其与疾病发生与发展的关系,分析HPV16 E6、E7基因多态性位点对宫颈癌进展的作用。方法:(1)提取188例新疆维吾尔族和汉族女性HPV16阳性感染的宫颈组织样本中的DNA,PCR扩增基因,并进行基因序列测定。将HPV16全基因组序列与欧洲型标准序列进行比对,并建立其进化树。(2)在宫颈癌C33A细胞中分别稳定转染HPV16 E6 295T/350T-GV230原型、HPV16 E6295G/350G-GV230和295T/350G-GV230突变型表达载体,HPV16 E7原型647A-GV144、HPV16 E7突变型647G-GV144以及HPV16 E6+E7原型E6-178T/E7-647A-GV144、HPV16 E6+E7突变型E6-178G/E7-647G-GV144重组表达载体。(3)于裸鼠的左后腿皮下接种E6不同多态性位点重组表达载体稳定转染的C33A细胞。每2-3天观察并测量裸鼠体重以及成瘤瘤体的大小,处死裸鼠取得瘤体后,称取各组瘤体的重量。(4)通过免疫组织化学实验和Western Blot实验检测凋亡相关蛋白Caspase 3,周期相关蛋白CDK 4,免疫相关蛋白IFN-κ和MHC-Ⅰ的表达情况,分析HPV16 E6原型E6-295T/350T、HPV16 E6突变型E6-295G/350G和E6-295T/350G,HPV16 E7原型E7-647A、突变型E7-647G以及HPV16 E6+E7原型(E6-178T/E7-647A)、突变型E6-178G/E7-647G四种重组表达载体对宫颈癌C33A细胞周期、凋亡和免疫功能的影响。(5)实验数据采用SPSS22.0进行统计学分析,P<0.05认为差异有统计学意义。结果:(1)对48例HPV16阳性的宫颈组织提取DNA并测序后,将全基因序列与欧洲标准株序列比对发现,48例样本均发生了核苷酸的变异,变异率为100%。在E1基因上24个位点的核苷酸发生了变化,其中发生A978G突变的样本量最大,占52.1%(25/48),引起氨基酸改变为异亮氨酸→蛋氨酸(I326M);E2基因序列上有23个位点的核苷酸发生了变异,C2546T突变在42例样本中存在,占据最高频率87.5%,该突变使脯氨酸变为丝氨酸(P219S);E5基因上发现7个位点发生了核苷酸的变化,有36例样本存在A3115C突变,频率为75%,该突变引起异亮氨酸变为亮氨酸(I44L);L2序列上有22个位点的核苷酸发生了变异,变异频率最高的位点为A4362C,占62.5%(30/48),氨基酸变化为亮氨酸→苯丙氨酸(L330F);L1基因上发现23个位点的变异,变异率达到最高(85.4%,41/48)的位点是A5570G,引起的氨基酸变化为苏氨酸→丙氨酸(T266A);E6上发现了16个位点的核苷酸变化,变异率最高的位点是A7220G,占45.8%(22/48),氨基酸由天冬氨酸变为谷氨酸(D32E);E7基因序列上发现8个位点的核苷酸发生了变化,有25例样本发生了A7689G突变,变异率为52.1%,氨基酸由天冬酰胺变为丝氨酸(N29S);LCR序列上,共发现34个突变位点,其中变异率最高的位点是G6657A,变异频率为93.75%。对序列进行进化树分析显示,该组样本HPV16感染类型主要是欧洲型,占70.8%(34/48),其次为亚洲型,占29.2%(14/48),没有发现亚美型和非洲型。(2)裸鼠于购入后3天接种稳定转染突变重组质粒的C33A细胞,自接种细胞当天至处死,共计30天,平均2-3天对裸鼠及瘤体观察测量一次。由裸鼠荷瘤模型实验分析得出,HPV16原型组、E6-295G/350G突变组、NC组之间终末平均瘤体体积差异无统计学意义(P>0.05),而HPV16E6-295T/350G突变组明显大于NC组以及其他实验组(P<0.05);经t检验比较,相比NC组,HPV16E6-295T/350G突变组终末瘤体重量明显增加(P<0.05)。(3)在细胞学实验中,HPV16 E6-295T/350G突变组与HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295G/350G突变组相比,Caspase 3的表达均有降低(P<0.01)。HPV16 E6-295T/350T原型组CDK4的表达高于HPV16 E6-295G/350G和HPV16E6-295T/350G两个突变组,且与HPV16 E6-295G/350G相比差异显著(P<0.05)。HPV16 E6-295T/350G突变组IFN-κ的表达用IHC和裸鼠瘤体中所提蛋白的Western Blot检测出的结果是均显著低于HPV16 E6-295T/350T(P<0.05)和HPV16 E6-295G/350G(P<0.05),而细胞Western Blot实验结果显示,IFN-κ的表达HPV16 E6-295G/350G突变组较HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16E6-295T/350G降低(P<0.01,P<0.001)。根据细胞Western Blot结果,HPV16 E6-295G/350G突变组MHC-Ⅰ的表达显著低于HPV16 E6-295T/350T原型组和HPV16 E6-295T/350G(P<0.001,P<0.01)。HPV16 E6-178G/E7-647G突变组Caspase 3的表达显著低于HPV16 E6-178T/E7-647A原型组和HPV16E7-647G单个点突变组(P<0.05);HPV16 E7-647A、HPV16 E7-647G、HPV16 E6-178T/E7-647A、HPV16E6-178G/E7-647G中,CDK4的表达均高于NC组;IFN-κ的表达在HPV16 E7-647A、HPV16 E7-647G、HPV16 E6-178T/E7-647A、HPV16 E6-178G/E7-647G中均降低,且HPV16 E7-647G突变比HPV16 E7-647A显著下降(P<0.05);仅IHC的结果显示,HPV16 E6-178G/E7-647G突变组MHC-Ⅰ的表达显著低于HPV16 E6-178T/E7-647A原型组(P<0.01)。结论:(1)新疆地区HPV16基因序列呈多态性分布,且以欧洲型(Ep)和亚洲型(As)为主要感染类型。(2)HPV16 E6-295T/350G突变更能促进宫颈癌的肿瘤生长。体外实验表明,HPV16E6-295T/350G抑制宫颈癌C33A细胞凋亡与促进其增殖的作用强于其原型及E6-295G/350G多态性位点。HPV16 E6-178G/E7-647G抑制宫颈癌C33A细胞凋亡与促进其增殖的作用强于其原型及E7-647G、E7-647A多态性位点。(3)HPV16 E6、E7突变可能通过降低免疫蛋白IFN-κ和MHC-Ⅰ的表达,进而影响宫颈癌患者的天然免疫功能,从而促进肿瘤的发生和发展。