L-丙氨酸、β-丙氨酸以及DL-丙氨酸为一类重要的手性药物中间体,在医药化工、食品、保健品和饲料等诸多行业应用广泛,目前国内外制备这类手性氨基酸的方法概括为两大类:化学合成法和生物酶法。生物酶法具有反应时间短、反应条件温和、酶专一性强、转化效率高以及低污染等优点,受到人们越来越多的关注,在工业上表现出了广阔地发展前景。本文研究的整体思路就是以来源广泛、价格低廉的顺丁烯二酸酐为初始原料,通过马来酸异构酶、天冬氨酸酶、天冬氨酸-α-脱羧酶、天冬氨酸-β-脱羧酶、丙氨酸消旋酶以及富马酸酶等多种生物酶的联合作用,制备β-丙氨酸、DL-丙氨酸以及L-苹果酸等系列产物。具体工作如下:1、以L-天冬氨酸为原料,通过天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶催化制备DL-丙氨酸。其中天冬氨酸-β-脱羧酶（Asd）和丙氨酸消旋酶（Alr）工程菌均为本研究中构建,选取了 pET-Duet和pGEX-KG两种表达载体,共构建四种基因工程菌,通过初步酶活性检测实验,筛选出以pGEX-KG质粒为载体的工程菌活性比含pET-Duet质粒载体活性高。pGEX-KG-Asd的最佳反应条件是45℃、pH 6.0;pGEX-KG-Alr 最优反应条件为 40℃、pH 7.0。pGEX-KG-Asd 在 16 h 内将200 g/LL-天冬氨酸转化,得到132 g/LL-丙氨酸,摩尔转化率达99%;pGEX-KG-Alr能在6h将200 g/LL-丙氨酸全部转化为DL-丙氨酸。30mL反应体系中,1.2 mmol/L PLP,双酶配比为Asd:Alr=1:2,以15%L-Asp为底物溶液,pH 7.0,40℃水浴反应10 h后,L-天冬氨酸转化率达99%以上。2、以顺丁烯二酸酐为初始原料,由马来酸异构酶催化得到富马酸,然后在天冬氨酸酶作用下合成L-天冬氨酸,最后经由天冬氨酸-α-脱羧酶脱羧制备β-丙氨酸。其中马来酸异构酶（maiA）工程菌为本研究构建,其最适转化条件为35℃-40℃,pH 7.0。构建了 pETDuet-maiA-PanD双酶共表达工程菌,其最适温度为45℃,最适pH为8.0。最后在各自最优条件下,通过比较多酶偶联和一菌双酶法制备β-丙氨酸的催化效率和产率,结果表明,在含有40g/L的顺丁烯二酸铵底物溶液中,多酶偶联体系下,反应12h后β-丙氨酸的生成量为29g/L,转化率达到97%;而一菌双酶体系中反应12 h后β-丙氨酸的生成量为17 g/L,转化率为57%。3、以富马酸为原料,利用富马酸酶（fumC）的催化制备苹果酸,本文选取了两种不同来源的富马酸酶基因,分别插入到pET-Duet上,最终导入到大肠杆菌细胞中,成功构建谷氨酸棒状杆菌（C.glutamicum）和大肠杆菌（E.coli）来源的fumC,分别命名为fumCc和fumCe。在各自最佳条件下,fumCc和fumCe催化含1.5 g富马酸钠的底物溶液,均在反应6h时L-苹果酸产量达到最高,产率分别为85%和34%。