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猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员,包括PCV1(Porcine circovirus type1, PCV1)和PCV2(Porcine circovirus type2.PCV2)两种基因型,其中PCV1为PK15细胞系的一种污染物,对猪无致病性；而PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。近年来PCV2已成为威胁世界养猪业的重要病原之一,并带来巨大的经济损失。目前国际上对PCV2命名进行规范(www.pcvd.net),主要分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三种基因型。猪群中PCV2a和PCV2b两种基因型广泛存在,自2004年以来主要以PCV2b基因型流行为主。PCV2c基因型仅二十世纪八十年代于丹麦报道,目前尚无流行。鉴于我国猪群PCV2感染广泛存在且危害严重,本研究对我国PCV2分子流行病学、抗原表位及其致病性进行系统研究,旨在为PCV2防控及致病机制研究奠定基础。本研究对我国部分地区PCV2分子流行病学调查,分离到19个PCV2流行毒株。该19株病毒分为PCV2a、PCV2b和PCV2d三个基因型,各占10.5%、73.7%和15.8%,其中PCV2d为新出现的基因型。4株病毒为1766nt,以1767nt毒株为基准,其第39或1039位有1个碱基缺失后突变成1766nt毒株。对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现,有4株病毒编码基因发生了突变,出现了705nt和708nt两种突变型,使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸延伸。本试验选用AccⅠ和FbaⅠ内切酶对该19株病毒基因组PCR产物进行了限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP),结果表明该方法可作为流行毒株分型鉴别手段。研究表明,我国猪群中流行的PCV2毒株以PCV2b基因型为主,同时也出现了PCV2d新基因型及基因组为1766nt的变异毒株。此外,试验也证实上述毒株的ORF2编码Cap蛋白的C末端有突变现象,表明我国PCV2流行毒株呈现多样性。PCV2-ORF2编码的Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,起免疫保护性抗原作用,对其进行抗原表位鉴定十分必要。本研究采用杆状病毒表达的重组Cap蛋白作为免疫原制备单克隆抗体,通过原核表达系统对ORF2基因进行了截短表达,先行对Cap蛋白抗原表位进行宽幅定位,然后利用合成多肽对Cap抗原表位做精确扫描定位。5株单抗中有4株均属于同一抗原表位,坐落在Cap蛋白N末端核定位信号区,经多肽扫描证实,核心序列为26RPWLVHPRHRY36另1株单抗(1D2)仅与重组Cap蛋白产生免疫活性反应,对4个分段截短表达的Cap蛋白无免疫活性反应,鉴于该单抗具有中和病毒活性,针对的可能是构象表位。本研究首次鉴定出位于Cap蛋白核定位信号区的一个抗原表位,填补了核定位信号区抗原表位研究的空白,为进一步Cap蛋白功能及核定位机理的研究奠定基础。PCV2感染引起的相关疾病日益严重,流行毒株基因不断发生变异,根据病毒基因组差异分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因型,还有PCV2d基因型新报道,这些不同基因型PCV2毒株的致病性差异有待阐明。采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株；拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50/mL;用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2)进行抗原捕获ELISA检测,拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应,另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应,表明属于不同基因型代表毒株。我国猪群中PCV2流行毒株存在不同基因型,其病毒抗原特性各异,构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株,为进一步研究其致病性差异奠定了基础。有关PCV2不同基因型自然重组的报道不断增多,其重组与病毒致病性和遗传进化关系尚不明确。本研究PK15细胞系模拟PCV2a和PCV2b不同基因型体外自然重组模型,选PCV2a基因型代表毒株PCV2a/CL1分别与两株PCV2b基因型代表毒株PCV2b/JF11和PCV2b/YJ进行共感染PK15,获得PCV2b(JF11)/2a(CL1)和PCV2b(YJ)/2a(CL1)两株不同基因型PCV2重组突变毒株,该重组突变毒株分别以其PCV2b基因型亲本毒为骨架,将其基因组位置1018nt～1767/1768nt分别替换为亲本毒PCV2a/rCL的相应基因片段,体外试验表明,与其亲本毒相比,该两株重组突变毒株体外复制效率显著增强,其抗原性也发生明显改变。为评价PCV2不同基因型、PCV2突变毒株及不同基因型PCV2重组毒株致病性差异,本研究分别选取PCV2不同基因型代表毒株PCV2a/rCL、PCV2b/rJF和PCV2d/rBDH; PCV2b基因型突变毒株PCV2b/rYJ;不同基因型PCV2重组代表毒株PCV2b(YJ)/2a(CL1)及其亲本毒进行动物感染试验,结果表明,与经典的PCV2a和PCV2b相比,新出现的PCV2d基因型PCV2d/rBDH及PCV2b突变毒株PCV2b/rYJ致病性显著增强(p<0.05),PCV2a和PCV2b基因型间致病性差异不显著(p>0.05)。此外,重组毒PCV2b(YJ)/2a(CL1)致病性与其亲本毒PCV2a/rCL1相似,但明显弱于其亲本毒PCV2b/rYJ(p<0.05)。有关PCV2致病机制尚不明确,本研究以非致病性PCV1基因组为骨架,分别替换PCV2-ORF2基因去除核定位信号区的相应基因片段及其相互重叠的截短基因片段,通过感染性克隆技术拯救嵌合病毒。对拯救的PCV嵌合病毒进行IPMA鉴定及测序,结果表明已成功获得3株PCV嵌合病毒,为进一步致病性研究奠定基础。