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猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病原,我国发现的位于PRRSV 5亚群的PRRSV类NADC30株自2013年以来广泛流行。PRRSV的糖蛋白GP4在PRRSV感染以及产生中和抗体过程中发挥重要作用,但对于具有中和活性GP4 MAb的制备与研究却鲜有报道。本研究目的是制备具有中和活性的PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体（MAb）并鉴定出MAb识别的抗原表位,对了解PRRSV基因组的结构与功能,以及进一步利用中和单抗对PRRS进行免疫防治具有非常重要的意义。本研究用纯化的PRRSV SD53株病毒免疫6周龄的BALB/c雌鼠三次,第三次免疫7天后,经IFA检测结果显示小鼠血清全部转阳。取血清已经转为阳性的小鼠脾细胞和骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合。经四次亚克隆,并对所筛选杂交瘤细胞分泌出的抗体进行稳定性验证,结果表明成功获得一株能够稳定分泌抗PRRSV MAb的阳性杂交瘤细胞株,命名为LM26;对所获得的阳性杂交瘤细胞大量培养,并以这株细胞制备腹水,收集制备的腹水,经亲和层析纯化,western blot分析结果表明,已经获得了纯化后的MAb。IFA测定MAb LM26的细胞培养上清及腹水的效价为1:16和1:1600。该MAb对北美洲型PRRSV SD53株具有中和活性,中和效价最低为1:6,最高为1:50。该MAb亚型为IgG2a亚类,轻链为κ链。本研究进一步明确了LM26为抗PRRSV GP4单抗,并精确鉴定其识别的抗原表位。首先,将PRRSV SD53株一系列结构蛋白的核酸序列扩增后回收,利用两个核酸内切酶切开,并将回收后的片段连入到pGEX-6P-1表达的载体中,把一系列重组表达的质粒构建出来,利用这些质粒,进行重组蛋白的诱导和表达,获得了一系列表达的结构蛋白短肽与GST的融合蛋白。western blot结果显示,一系列重组蛋白均成功表达,且LM26仅与PRRSV重组表达后的GP4蛋白能够特异性的结合。其次,将测序正确后的质粒pCAGGS-FLAG-GP4瞬时转染到293T细胞作为检测抗原,用IFA验证已经成功表达的重组GP4蛋白与LM26反应,证明抗PRRSV GP4 MAb已经被成功的制备。最后,对该MAb识别GP4蛋白上抗原表位进行鉴定,western blot结果显示LM26识别GP4蛋白的aa 57aa 62(57VVLQDI62)。将序列57VVLQDI62与在GenBank中下载的28株国内外PRRSV株GP4氨基酸序列比对,结果显示,位于GP4蛋白的aa 57aa 62这段序列,在HP-PRRSV株以及类NADC30 PRRSV株中呈现高度保守;在经典PRRSV株中存在2个突变位点,分别是V57A和Q60H;在欧洲PRRSV株中存在1个突变位点V57M。然而,IFA检测结果显示,LM26与疫苗株HuN4-F112、CH-1R、MLV、TJM-F92反应,与欧洲株DV、VP046BIS不反应,由此推测V57A、Q60H突变不影响LM26对抗原表位的识别,该表位在美洲型PRRSV中相对保守。综上所述,本研究成功制备出一株具有中和活性的抗PRRSV GP4蛋白MAb,并鉴定了其识别表位位于GP4蛋白57VVLQDI62,该MAb有助于进一步研究PRRSV基因组的结构和功能。