目前,利用血管生成抑制类药物来抑制血管新生已经成为治疗肿瘤等血管新生类疾病的重要思路和方向。在目前所发现的血管生成抑制类因子中,人纤溶酶原的第五个环饼区,即Kringle5,是目前发现的抑制血管内皮细胞增殖作用特异性较高,毒副作用较小,且活性较强的抑制血管新生类物质,因此,Kringle5在肿瘤等血管新生类疾病的临床治疗方面具有巨大的潜力和应用价值。本工作将光谱法、亲和色谱法等实验方法以及分子对接、热力学和动力学模拟等理论预测方法相结合,研究了变性剂诱导的基因重组血管生长抑制剂Kringle5的结构变化过程以及一些小分子配体与血管生长抑制剂Kringle5之间的相互作用,为阐明血管生长抑制剂Kringle5的作用机理以及进一步对其药理药效的调控提供了一些新的视野。1.综合利用内源荧光光谱法、荧光相图分析、荧光探针以及荧光猝灭等方法监测表征了血管生长抑制剂Kringle5在盐酸胍和脲诱导下的展开-重折叠过程中的结构变化特征。结果显示,在盐酸胍和脲诱导的Kringle5的去折叠和重折叠过程中均不存在折叠中间态,即]Kringle5的去折叠和重折叠过程均符合“二态模型”。在盐酸胍和脲诱导的去折叠过程中,蛋白质分子内部的疏水区域逐渐暴露,暴露在蛋白表面的能被猝灭剂猝灭的荧光基团占总荧光基团的比例分别由59.2%上升至85.5%和由59.2%上升至83.3%；在盐酸胍和脲诱导的Kringle5重折叠过程中,蛋白分子内部重新形成疏水区域,暴露在蛋白表面的能被猝灭剂猝灭的荧光基团占总荧光基团的比例分别由88.3%下降至60.2%和由84.1%下降至61.1%。由本部分实验初步推测盐酸胍和脲诱导的Kringle5的去折叠和重折叠过程分别是经由同一路径的相互可逆的反应过程。2.利用光谱法、分子模拟对接技术并辅以热力学、动力学预测方法研究了不同温度下Kringle5与五种小分子配体(L-赖氨酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、氨甲环酸以及苄胺)的相互识别过程以及二者在相互作用过程中的作用状态、作用强弱、结合位点、作用力类型、作用距离以及作用过程中的热力学和动力学参数,同时研究了Kringle5分子内氨基酸残基和小分子配体中官能团的分布和对接。结果发现,Kringle5与五种配体之间的猝灭反应速率常数Kq均大于2×1010L·mol-1·s-1,且猝灭速率常数KSV均随着实验温度的升高而减小,表明Kringle5与五种配体间均由于形成了不发荧光的络合物而产生了静态猝灭现象；测定了不同温度下Kringle5与五种小分子配体的结合常数与结合位点数,发现Kringle5与五种配体的作用强度由强至弱的顺序为：氨甲环酸>6-氨基己酸>苄胺>7-氨基庚酸>L-赖氨酸；通过计算获知Kringle5与五种配体相互作用过程中的吉布斯自由能变、焓变、熵变以及表观活化能均为负值,说明Kringle5与五种配体都是以氢键和范德华力为主要作用力的自发的、放热的反应过程且反应过程中不存在能垒；利用Forster非辐射能量转移理论获知五种配体均同Kringle5分子发生了非辐射能量转移且与Kringle5分子中色氨酸残基的平均作用距离相差不大；通过分子模拟对接技术发现,五种配体与Kringle5分子的结合成键情况各不相同：氨甲环酸与Kringle5分子结合形成了两条氢键以及一个阳离子-π互作用,6-氨基己酸与Kringle5结合形成了两条氢键以及一个阳离子-π相互作用,苄胺与Kringle5结合形成了一条氢键,一个苯环-苯环共轭相互作用以及两个阳离子-π互作用,7-氨基庚酸与Kringle5结合形成一条氢键以及一个阳离子-π相互作用,L-lysine与Kringle5结合形成一条氢键一个阳离子-π相互作用；最后,在对比五种小分子结构差异的基础上,探讨了Kringle5蛋白更为偏向的配体分子的结构类型。3.利用亲和色谱技术,通过重氮盐反应将Kringle5蛋白键合到了硅胶基质上,并初步建立了一套利用亲和色谱的方法来研究Kringle5与小分子配体相互作用的实验方法。结果显示,将Kringle5键合到硅胶基质上后,色谱柱分离情况良好；经过前沿色谱分析所得到的Kringle5与五种小分子配体相互作用过程的结合常数与通过光谱法得到的结合常数数量级相同且作用强弱排序一致。说明该方法可以用于研究Kringle5与配体分子间的相互作用,并为进一步研究奠定了方向与基础。