【摘 要】
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研究背景和目的:骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微结构退化为特征的全身性代谢性疾病。绝经后骨质疏松症是由于绝经期女性雌激素迅速下降,破骨细胞的骨吸收活性显著增加,而成骨细胞活性却未相应增加,导致骨吸收超过骨形成而引起的。目前的骨质疏松治疗药物因其疗效有限,且存在各种不同的副作用,因此研发既能抑制破骨细胞的生成及骨吸收功能的药物以治疗骨质疏松一直是研究的热点。中国特色中草药单体属于天然活性产物,其
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研究背景和目的:骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微结构退化为特征的全身性代谢性疾病。绝经后骨质疏松症是由于绝经期女性雌激素迅速下降,破骨细胞的骨吸收活性显著增加,而成骨细胞活性却未相应增加,导致骨吸收超过骨形成而引起的。目前的骨质疏松治疗药物因其疗效有限,且存在各种不同的副作用,因此研发既能抑制破骨细胞的生成及骨吸收功能的药物以治疗骨质疏松一直是研究的热点。中国特色中草药单体属于天然活性产物,其中部分生物碱类中草药单体具有抗炎、抗骨质疏松等作用,且同时具有副作用小、价格适宜等优点,因此成为抗骨质疏松治疗的热门。文多灵是一种从长春花中提取出来的吲哚生物碱,是合成抗癌药长春碱的前体,具有抗炎、抗氧化等作用,但它对骨代谢的影响尚不清楚。我们的研究发现,文多灵能够抑制破骨细胞分化,骨吸收和破骨细胞生成相关基因的表达,同时还能抑制卵巢切除后引起的骨丢失。实验方法:实验分为体外实验和体内实验两部分进行。（1）体外实验:1)首先提取C57/BL6小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）,在存在巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）的情况下,进行CCK-8实验来测定文多灵对BMMs增殖的影响。选取对BMMs增殖没有影响的药物浓度,在MCSF存在的情况下,予RANKL诱导BMMs向破骨细胞分化,同时加入不同浓度的文多灵观察其对破骨细胞分化的影响。2)用含有MCSF和RANKL的完全培养基培养BMMs细胞至分化成未成熟破骨细胞,然后重新种在羟基磷灰石骨板上继续培养直至形成成熟的破骨细胞,同时加入不同浓度的文多灵进行干预,观察其对破骨细胞骨吸收功能的影响。我们还进行了F-actin环实验,观察文多灵对F-actin环的形成有无影响。鉴于ROS水平与破骨细胞形成有关,我们检测了不同浓度的文多灵对细胞内ROS生成的影响。3)提取SD大鼠成骨前体细胞,诱导其向成骨分化,后进行碱性磷酸酶（ALP）染色,评估文多灵对成骨细胞分化的影响。4)进行实时荧光定量PCR检测破骨细胞相关基因的表达,并通过蛋白免疫印迹技术（Western Blot）探究影响破骨细胞分化和骨吸收功能的相关信号通路。（2）体内实验:构建卵巢切除诱导的骨质疏松模型。取24只12周龄雌性小鼠,随机分成4组:假手术组（假手术+生理盐水）、OVX组（OVX+生理盐水）、低剂量组（OVX+5mg/kg文多灵）、高剂量组（OVX+10mg/kg文多灵）,并进行相应处理,后进行Micro-CT检测和组织学分析。结果:（1）体外实验:1)文多灵可以抑制破骨细胞的分化和形成;2)文多灵可以抑制破骨细胞的骨吸收功能;3)文多灵对成骨细胞的分化没有促进作用;4)文多灵能抑制破骨细胞相关基因的表达;同时文多灵通过抑制MAPK信号通路来抑制破骨细胞形成和功能。（2）体内实验:文多灵能有效抑制OVX诱导的骨质疏松模型的骨丢失。结论:文多灵通过MAPK和NFATc1信号通路抑制破骨细胞形成和功能,并且文多灵对OVX引起的骨丢失有抑制作用,因此该化合物可能具有防治骨质疏松症的潜在疗效。
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