【摘 要】
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目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,具有较高的发病率和死亡率。遗憾的是,由于缺乏全面的细胞和分子机制,目前尚无治疗肝细胞癌的高效药物。脾酪氨酸激酶（Spl een tyrosine kinase,SYK）可以在多种受体的参与下调控免疫细胞的激活,使其成为治疗炎症、自身免疫性疾病以及一些B细胞恶性肿瘤的潜在靶点。PRT062607
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目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,具有较高的发病率和死亡率。遗憾的是,由于缺乏全面的细胞和分子机制,目前尚无治疗肝细胞癌的高效药物。脾酪氨酸激酶（Spl een tyrosine kinase,SYK）可以在多种受体的参与下调控免疫细胞的激活,使其成为治疗炎症、自身免疫性疾病以及一些B细胞恶性肿瘤的潜在靶点。PRT062607 HCI是一种新型的、高选择性的小分子SYK抑制剂,其作用于SYK的选择性比作用于其他激酶高80倍以上。PI3K-Akt-m TOR信号通路是哺乳动物细胞内重要的信号传导通路之一,在多种恶性肿瘤发生发展的过程中发挥重要作用。本研究以人肝癌Huh7细胞作为实验对象,探讨脾酪氨酸激酶抑制剂PRT062607 HCI对Huh7细胞生物学行为的影响及其作用机制,为其开发和临床应用提供实验依据。方法:不同浓度的脾酪氨酸激酶抑制剂PRT062607 HCI作用于人肝癌Huh7细胞不同的时间,通过CCK-8法检测PRT062607 HCI对Huh7细胞增殖能力的影响;通过克隆形成实验检测PRT062607 HCI对Huh7细胞克隆形成能力的影响;通过流式细胞术检测PRT062607 HCI对Huh7细胞凋亡和细胞周期的影响;通过划痕实验检测PRT062607 HCI对Huh7细胞横向迁移能力的影响;通过Transwell法检测PRT062607 HCI对Huh7细胞纵向迁移能力和侵袭能力的影响;通过Western Blot检测PRT062607 HCI对Huh7细胞凋亡、细胞周期、迁移侵袭和自噬相关蛋白表达的影响;通过W estern Blot检测PRT062607 HCI对Huh7细胞PI3K-Akt-m TOR信号通路的影响。结果:不同浓度的脾酪氨酸激酶抑制剂PRT062607 HCI作用于人肝癌Huh7细胞48和96h后,CCK-8法检测结果显示细胞增殖活性显著降低,并且呈现一定的浓度依赖性;根据药物作用48h的IC50=6.11μmol/L和作用96h的IC50=7.53μmol/L,选择浓度为1.25、2.5和5μmol/L的PRT062607 HCI进行后续实验。PRT062607 HCI作用于Huh7细胞24h后,克隆形成实验检测结果显示细胞克隆形成率显著降低,并且细胞克隆形成率随着药物浓度升高而降低;流式细胞术检测结果显示细胞凋亡率显著升高,并且细胞凋亡率随着药物浓度升高而升高;Western Blot检测结果显示Cle aved Caspase-3和Bax的表达水平升高而Bcl-2的表达水平降低,并且呈现一定的浓度依赖性;流式细胞术检测结果显示处于G0/G1期的细胞比例显著升高,并且处于G0/G1期的细胞比例随着药物浓度升高而升高;West ern Blot检测结果显示CDK2和Cyclin D1的表达水平降低,并且呈现一定的浓度依赖性;PRT062607 HCI作用于Huh7细胞24和48h后,划痕实验检测结果显示划痕愈合率显著降低,并且划痕愈合程度随着药物浓度升高而降低;PRT062607 HCI作用于Huh7细胞24h后,Transwell法检测结果显示纵向迁移率和侵袭率显著降低,并且纵向迁移率和侵袭率随着药物浓度升高而降低;Western Blot检测结果显示MMP2和Vimentin的表达水平降低,并且呈现一定的浓度依赖性;PRT062607 HCI作用于Huh7细胞24h后,Western Blot检测结果显示LC3B-Ⅱ和Beclin-1的表达水平升高而p62的表达水平降低,并且呈现一定的浓度依赖性;Western Blot检测结果显示p-PI3K、p-Akt、p-m TOR和p-p70S6K的表达水平均降低,并且呈现一定的浓度依赖性。结论:脾酪氨酸激酶抑制剂PRT062607 HCI可能通过抑制PI3K-Akt-m TOR信号通路的磷酸化,进而抑制人肝癌Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并且诱导细胞凋亡和改变细胞周期分布。
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