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研究背景:乳腺癌（BC）是21世纪主要的癌症死亡原因之一,在发达国家和发展中国家的女性中,乳腺癌仍然是最普遍的癌症[1]。尽管在早期诊治和系统治疗方面取得了一些进展,但复发、转移、耐药仍然是乳腺癌治疗成功的关键,所以发现乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移的有关基因,并寻找新的乳腺癌潜在靶点和靶向药物迫在眉睫。长链非编码RNA（lnc RNA）是一类长度超过200个核苷酸的nc RNAs,且具有有限的或者没有蛋白质编码功能,lnc RNA通过转录、转录后、表观遗传学等水平上调控基因的表达,在疾病的各种生物学过程中发挥着重要的作用,逐渐受到研究者的关注。近年来,随着对lnc RNA了解的不断深入,越来越多的证据表明长链非编码RNA（lnc RNA）在乳腺癌的发生和发展过程中起着关键作用。但大多数lnc RNA在乳腺癌中的作用仍不清楚。大量的证据表明,许多lnc RNA可以通过竞争性结合普通miRNA发挥内源性miRNA海绵的作用。研究发现,多种恶性肿瘤中存在LINC00665水平异常表达的现象,其中包括肝癌、胃癌、肺癌等。然而LINC00665是否影响乳腺癌的进展及其作用机制尚无报道。研究目的:本研究旨在揭示LINC00665在乳腺癌发生发展中的作用及其涉及的分子作用机制,为乳腺癌的治疗提供潜在的治疗靶点,为乳腺癌的预后提供新的诊断指标。研究方法:1.通过RT-qPCR检测常用的乳腺癌细胞系中LINC00665的表达差异,之后选取LINC00665表达量较高的细胞系MDA-MB-231进行降表达试验,选取LINC00665表达量较低的细胞系T47D进行过表达试验。分别采用MTT、克隆形成、Ed U实验测定LINC00665对乳腺癌细胞增殖能力的影响。通过Transwell、细胞伤痕愈合实验观察LINC00665调控后细胞迁移能力的改变;2.通过在乳腺癌细胞过表达LINC00665后,使用Western Blotting、RT-qPCR和免疫荧光实验方法检测EMT标记物的表达变化;3.通过在线数据库预测LINC00665可能与其相互调控的竞争性内源性RNA及其相互作用的miRNA。通过预测LINC00665和下游靶mRNA以及两者与其共同作用的miRNA相互结合的位点,之后构建相应的结合位点突变载体和工具载体,进行荧光素酶报告基因实验和RNA免疫共沉淀（RIP）实验共同验证LINC00665与下游miRNA的直接结合和具体结合位点;4.在过表达或干扰LINC00665后,采用RT-qPCR实验方法验证候选miRNA的表达量改变,从而进一步验证LINC00665的关键下游miRNA分子;5.通过了双重荧光素酶报告基因检测,以验证LIN28B与miR-379-5p的靶相作用,并通过RT-qPCR验证过表达或干扰miR-379-5p的细胞LIN28B的mRNA表达水平变化。通过蛋白质印迹法检测miR-379-5p干扰的细胞以及过表达miR-379-5p细胞中LIN28B的蛋白表达水平;6.在MDA-MB-231细胞系中干扰LINC00665或在T47D细胞系中过表达LINC00665后,通过RT-qPCR及Western Blotting实验检测LIN28B的表达变化以及EMT指标的表达变化。进行“回复”（Rescue）实验即共转染LINC00665和LIN28B的si RNA,再次通过Western Blotting实验检测LIN28B以及EMT标志物的表达差异。并通过克隆形成实验、MTT观察乳腺癌细胞的增殖能力,并通过Transwell观察其是否减弱乳腺癌细胞的迁移能力。研究结果:1.RT-qPCR结果表明,LINC00665在不同的乳腺癌细胞系中表达量存在差异。LINC00665在MDA-MB-231和BT549胞系中表达量较高,在T47D细胞系中表达较低。MTT、克隆形成、Ed U实验证明MDA-MB-231和BT549细胞系中干扰LINC00665后,细胞增殖能力下降;在T47D细胞系中过表达LINC00665后,细胞增殖能力增强,LINC00665促进乳腺癌细胞增殖。Transwell、细胞伤痕愈合实验结果表明在MDA-MB-231和BT549细胞系中干扰LINC00665后,细胞迁移能力下降;在T47D细胞系中过表达LINC00665后,细胞迁移能力增强。2.Western Blotting结果表明过表达LINC00665的T47D细胞中的间充质标记Vimentin和N-cadherin显著上调,E-cadherin表达量显著下调。免疫组化染色结果相同。3.通过star Base数据库预测,选定LINC00665可能相互调控的下游靶基因包括LIN28B,miRNA选定miR-379-5p,并利用荧光实时定量PCR实验验证LINC00665对miR-379-5p的海绵吸附作用。接下来通过RNA免疫共沉淀实验和荧光素酶报告基因实验进一步证实LINC00665与下游miR-379-5p的相互作用关系。4.双重荧光素酶报告基因检测以及RT-qPCR、Western Blotting（蛋白质印迹法）实验结果均证实miR-379-5p能靶向调控LIN28B的表达。5.通过Western Blotting实验结果表明过表达LINC00665后,LIN28B表达量增加,E-cadherin显著下调,但间充质标记Vimentin和N-cadherin显著上调,回复实验结果LIN28B表达下调,间充质标记N-cadherin和Vimentin表达量减少,并且E-cadherin显著上调。并且共转染LINC00665和LIN28B的si RNA后细胞的增殖能力和迁移能力均减弱。研究结论:1.LINC00665在乳腺癌中具有促进癌细胞增殖的作用,并且能够促进乳腺癌细胞的迁移;2.在乳腺癌细胞中LINC00665参与诱导了EMT样表型;3.LINC00665对LIN28B的表达具有正调节作用,并且LINC00665对LIN28B的调节作用及对乳腺癌细胞增殖、迁移、上皮间质转化的功能的影响依赖于miR-379-5p。