随着现代的细胞和分子免疫学的发展，人们已经基本明确机体在肿瘤的免疫识别和免疫调节过程中的分子机制，在此基础上，研究特异性的肿瘤疫苗正逐渐成为肿瘤生物治疗的重要手段。但是由于缺乏特异抗原和有效的抗原递呈，以及MHC的限制和肿瘤异质性等原因，使现有肿瘤疫苗的使用范围和效果相当有限。Hsp70是一个高度保守的蛋白，其在蛋白的转运、折叠以及抗原的加工递呈过程中均具有重要作用。研究表明，Hsp70可作为一种分子载体，增强与其结合蛋白的抗原性。MAGE-1是一种广泛证实的肿瘤特异性抗原，其在多种肿瘤中均有表达，而在正常组织细胞(除睾丸外)均不表达。本研究构建以Hsp70为疫苗载体，MAGE-1为靶抗原的肿瘤DNA疫苗与蛋白疫苗，并研究疫苗对机体细胞及体液免疫的作用，以及对小鼠肿瘤模型的治疗作用。 1．采用RT-PCR从HepG2细胞总RNA中克隆MAGE-1的基因，经测序，与GeneBank公布的序列一致；对MAGE-1基因编码的蛋白的理化性质进行分析表明MAGE-1的前100个氨基酸残基的疏水性较高，并可能含有一个跨膜序列，其后100个氨基酸残基的抗原性较高；通过Blast软件对MAGE-1编码的蛋白进行特异性分析表明，MAGE-1蛋白的后100一个氨基酸残基具有相对较高的特异性；构建MAGE一的全长和分段原核表达质粒，并分别进行表达，结果显示，MAGE上的全长表达量甚低，而截去前10o个氨基酸残基后M人＊B1乃7习09—）的表达量明显升高：通过对 MAGEA 门）进行原核表达与分离纯化，获得 MAGEJ （194309a）的纯化蛋白，制备 MAGE－l的抗血清，琼脂双扩实验显示，抗血清经1：32稀释后能够与＊＊＊卜1门9个309—）形成抗原抗体沉淀：采用固化 GST蛋白的 Sephrose 4B进行交叉吸附，中和抗血清中针对 GST蛋白的成分后，ELISA表明，抗血清在 1：10，000的情况下能够与抗原结合，Western Blot结果显示抗血清能够与 MAGE．l特异性结合，而不与GST蛋白结合。 工 构建MAGEA的逆转录病毒质粒pLXSN－MAGE刁，经包装细胞PA3包装后，感染小鼠 BI6细胞，经筛选获得 BI6－MAGE－l细胞，RT－PCR检测有 MAGE－l的转录，Western Blot检测到与 MAGE－l抗血清结合的46kDa的蛋白。采用PCR从结核杆菌标准株H37Rv的基因组中克隆HsP70基因，除含有一个苍蝇已突变外其余序列与GeneBank公布的一致；构建MAGE1的真核表达质粒pCDNA－MAGE＊，HSp70的真核表达质粒pCDNA－HSp70，以及二者的融合真核表达质粒pCDNA－MAGE刁；分别采用DNA疫苗免疫C57BL／6 ’J’鼠，采用IFN－Y ELISPOT及培养上清中几上的 ELISA检测结果显示，融合DNA疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对 BI6－MAGEJ的特异性 T细胞数量相对于其它各组明显增加中阿对5）；采用LDH释放实验对脾淋巴细胞毒性的检测，结果显示融合 DNA疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞对 BI6．MAGE1细胞的杀伤明显升高，而对以 细胞的杀伤相对于其它组并没有明显变化中＞0刀5人间接ELISA结果显示，融合DNA疫苗免疫的小鼠血清中抗MAGE－l的抗体水平没有明显增高。在小鼠的肿瘤模型的治疗实验中， — —一一显示融合 DNA疫苗对 BI6－MAGE－l肿瘤模型具有良好的治疗作用。 3．分别对HSp70和MAGEq进行原核表达与分离纯化，获得HSp70和MAGE4的纯化蛋白；构建MAGE＊与HSp70融合基因原核表达质粒pGEX－MAGE八，并进行原核表达和分离纯化，获得MAGEq与HSp70的融合蛋白；分别采用蛋白疫苗免疫 C57BL／6小鼠lFN． ELISPOT和IL毛 ELISA检测结果显示，融合蛋白疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对B16－MA GEq的T细胞数量明显升高中功．05）；LDH释放实验结果显示，融合蛋白免疫的小鼠，脾淋巴细胞对 BI6－MAGE1的毒性明显增强 b＜0刀5＊而对＊ 细胞的杀伤作用较弱。间接ELISA结果显示，融合蛋白能够提高机体对M人＊E1的抗体水平平＜0刀5人 本研究成功地克隆了MAGE－l的基因，并进行了原核表达，在国内首次制备了 MAGE．1的抗血清，发现 MAGE．l的前 100个氨基酸残基中可能存在的跨膜序列对蛋白的原核表达具有一定的影响。本研究首次构建了MAGE4与HSp70的融合DNA疫苗，研究结果显示其能够激活小鼠的细胞免疫反应，对小鼠肿瘤模型具有良好的治疗作用。融合DNA疫苗对小鼠的体液免疫作用较弱。本研究首次制备了MAGE＊与HSp70的蛋白疫苗，研究结果表明融合蛋白疫苗能够激活小鼠的细胞免疫和体液免疫反应。 综上所述，我们首次构建了MAGE一 融合DNA疫苗及融合蛋白疫苗，两种疫苗均能够激活机体的抗肿瘤免疫效应，此外HSp70作为一种疫苗载体，可明显增强MAGE．l的免疫原性，为新型肿瘤疫苗研究奠定了基础。