【摘 要】
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目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因,观察和验证纯合子表型,初步探讨Lkb1对肾小管发育的影响。方法针对斑马鱼lkb1基因设计并体外合成gRNA,通过显微注射技术将gRNA和Cas9 mRNA注入野生型胚胎一细胞期卵黄中,利用T7E1酶切和测序筛选出高效gRNA,通过测序筛选出F0代突变体及可遗传突变体,野生鱼和可遗传突变体鱼杂交产生F1代杂合子突变体,测序鉴定F1代杂合子突变
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目的利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因,观察和验证纯合子表型,初步探讨Lkb1对肾小管发育的影响。方法针对斑马鱼lkb1基因设计并体外合成gRNA,通过显微注射技术将gRNA和Cas9 mRNA注入野生型胚胎一细胞期卵黄中,利用T7E1酶切和测序筛选出高效gRNA,通过测序筛选出F0代突变体及可遗传突变体,野生鱼和可遗传突变体鱼杂交产生F1代杂合子突变体,测序鉴定F1代杂合子突变类型,通过F1代杂合子自交产生F2代纯合子幼鱼,通过观察鉴定出纯合子表型;通过RT-PCR和免疫印迹验证纯合子表型;通过RT-PCR检测肾小管标志蛋白的mRNA水平。结果制备了斑马鱼lkb1 gRNA和Cas9 mRNA,筛选出三种产生移码突变的杂合子,发现斑马鱼lkb1基因敲除纯合子幼鱼受精后第5天游动时头尾剧烈摆动,异常兴奋,鱼鳔缺失,体轴弯曲,卵黄消耗过快,肝脏暗淡,肠道水肿,第8天大多数死亡;纯合子g6pase,pdk2b,pcpck1mRNA显著升高,Lkb1完全不表达;肾小管标志蛋白mRNA显著升高。结论利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼lkb1基因,产生了肝脏衰竭,肠道水肿,体轴弯曲,鱼鳔缺失,早期致死的表型;lkb1对斑马鱼肾小管发育有影响。
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