干旱是造成粮食减产的主要因素之一,全球范围内每年因干旱造成的粮食减产比例高达50%。作物的抗旱性状由多基因控制、抗旱机制错综复杂。目前,不仅抗逆相关的功能基因较少、即使能够转移单一基因、其效果也非常有限。作物的野生近缘物种是栽培作物抗逆改良的重要基因库,但这些野生种与栽培种远缘杂交很难成功。利用不对称体细胞杂交技术可以克服远缘不亲和性,不仅可以向栽培种转移野生近缘种质中的耐逆基因、而且有望同时转移整个抗逆性状相关途径的多个基因。本实验室以普通小麦(Triticum aestivum L.)济南177胚性悬浮细胞来源的原生质体为受体,野生耐盐近源植物长穗偃麦草(Agropyron elongatum Host Nevski)悬浮细胞系原生质体经紫外线照射后为供体,进行不对称体细胞杂交,在国际上首次获得了体细胞杂种渐渗系。经过连续多年的实验室及大田实验,从中筛选出一个既抗盐又抗旱的新品系,经山东省品种审定委员会审定后定名为山融3号(鲁农审字第[2004]030)。本论文以山融3号及其受体亲本济南177为试材,通过苗期生物性状初步调查、渗透胁迫条件下相关生理指标测定、全基因组表达谱分析、功能基因克隆及功能鉴定等几个方面的工作,对山融3号抗渗透胁迫的机理进行了初步研究。主要结果如下：1、生物学性状调查结果①苗期控水试验结果表明：三叶一心期幼苗经控水致使其完全青干后再浇水,80%以上的山融3号青干的幼苗均能恢复生长,而济南177则不能恢复；②种子萌发期在20%PEG渗透胁迫条件下胚芽鞘及主根的伸长试验表明：山融3号胚芽鞘长度从一级(芽鞘长度>30mm,抗旱性最强)到五级(芽鞘长度<24mm,抗旱性最弱)呈正态分布,其中二、三级占整个群体的50%以上。而济南177则呈现明显偏态分布,五级最多,二、三级仅占群体的10%。主根伸长试验表明,渗透胁迫条件下,山融3号主根明显长于济南177;③室内二叶一心期幼苗经10%PEG渗透胁迫处理一周后两者的根系发育状况显示：山融3号总根长、总根表面积以及侧根数均显著高于济南177；④三叶一心期幼苗离体叶片失水率试验结果表明：山融3号幼苗的离体叶片失水率显著低于济南177。2、抗渗透胁迫相关生理指标测定最佳PEG处理浓度的确定：山融山号和济南市77三叶一心期幼苗经15%、18%和20%PEG渗透胁迫处理,对处理后24h和48h时根和叶中脯氨酸含量和POD活性进行了测定和比较,结果表明：在两个时间点,济南177根和叶中脯氨酸的含量以及POD活性以15%PEG处理浓度下最高；而山融3号则在18%PEG、有的指标甚至在20%PEG渗透胁迫处理下最高,据此确定选择18%PEG浓度为最佳处理浓度。用18%PEG胁迫处理三叶一心期幼苗,测定了处理0、3、6、12、24h时根和叶中渗透调节或ROS代谢相关指标,结果表明：山融3号叶片中脯氨酸和可溶性糖的净积累显著超过济南177；胁迫处理24h时,山融3号叶片相对含水量较高、叶片汁液渗透势较低。在各个处理时间点测得的山融3号根叶中的活性氧含量显著高于济南177、处理后SOD活性的净增加显著超过济南177,这导致山融3号各组织中MDA含量的净积累显著低于济南177。同时胁迫处理前后,山融3号总的抗坏血酸和谷胱甘肽含量显著高于济南177。在孕穗期,对田间正常生长以及干旱处理条件下山融3号和济南177旗叶叶绿素荧光参数进行了测定。从对照条件下两者的光响应(ETR)曲线、有效光化学效率(Yield)曲线以及光化学萃灭(pP)的变化情况看,山融3号的光合作用能力显著高于济南177；干旱处理以后,上述各项指标均出现不同程度的下降趋势,但山融3号仍表现出较强光合作用能力。3、苗期山融3号和济南177在对照及渗透胁迫条件下的基因表达谱分析对三叶一心期幼苗进行了对照及渗透胁迫处理条件下全基因组表达谱分析,结果显示：即使在对照条件下,山融3号叶片中有2949个探针的表达与济南177有显著差异,其中2195个探针的表达比济南177的强,754个的表达较弱；根中共有6390个差异表达的探针,其中在山融3号中表达增强的有3928个,表达较弱的有2462个；18%PEG渗透胁迫处理之后,在山融3号叶片中,共发现1187个探针与济南177有显著差异,其中639个探针的表达比济南177的高,548个的表达较弱；根中共有1457个差异表达的探针,其中在山融3号中表达较强的有959个,表达较弱的有498个。根叶中差异表达的探针数目较处理前明显减少。对胁迫处理后差异表达的探针在山融3号中渗透胁迫响应分析表明：64%的探针属于组成型差异表达,仅有36%探针对渗透胁迫有响应。随机选择部分探针进行RT-PCR验证,证明了基因芯片的结果是可靠的；GO注释揭示了大量胁迫响应基因,其中注释为putative CEO protein的一个差异表达明显的探针引起了我们的关注。4、抗渗透胁迫相关功能基因TaCEO1的等位变异采用RACE技术克隆了山融3号中渗透胁迫响应重要功能基因TaCEO1基因家族的4个成员,分别命名为hTaCEO1-1、hTaCEO1-2、hTaCEO1-3和hTaCEO1-4;通过双亲及杂种基因组序列的亲缘关系比较分析,发现hTaCEO1-1.hTaCEO1-2.hTaCEO1-3分别来自亲本济南177同源基因的等位变异。已将TaCEO1-1定位于小麦染色体4A上。利用生物信息学方法比较了山融3号和济南177中各TaCEO1的共价修饰位点和可能的结构域,结果表明它们均具有PARP催化结构域,同时hTaCEO1-1在N—端还具有重要功能域WWE-domain、分子结构中具有核定位信号。5、hTaCEO1的功能鉴定对来自体细胞杂交渐渗系山融3号的两个CEO1进行胁迫响应差异表达分析和酵母突变体功能互补比较研究,发现两者在山融3号和济南177渗透胁迫处理的根部大幅上调,且TaCEO1-1在山融3号根部的上调幅度超过济南177；将来源于山融3号的hTaCEO1-1和hTaCEO1-2转化酵母突变体yap-1,过氧化氢抗性试验证明hTaCEO1-1比hTaCEO1-2具有更强的抗氧化能力：进一步将hTaCEO1-1转化拟南芥Col-0野生型。研究发现,hTaCEO1-1的过量表达改变了转基因拟南芥细胞的氧化还原状态。正常条件下使转基因植株维持较高的NAD(P)+/NAD(P)H比值,促进了转基因植株物质代谢和能量代谢的进行；这一方面导致转基因株系比对照生长速度快、另一方面活跃的代谢导致转基因株系细胞活性氧含量增加；增加的ROS作为一种信号分子使ROS抗性相关基因表达发生变化,其中定位于线粒体内并与线粒体氧化损伤相关的At2g21640在转基因株系中大幅下调：转基因植株对各种胁迫的抗性明显增强。6、结论从上述分析结果可以看出,对照条件下,山融3号苗期细胞活性氧含量高,导致细胞处于活跃的氧化态；将山融3号中分离到的基因hTaCEO1-1在拟南芥中的过量表达导致了拟南芥细胞氧化还原状态发生了改变,细胞活性氧含量增加、活性氧清除酶活性降低。于此同时,山融3号和拟南芥都表现出对氧化、渗透、盐等非生物胁迫的抗性。由此推断：hTaCEO1-1对增强山融3号的抗逆性发挥了重要的作用。