目的出血性脑卒中是脑卒中的一个亚型,具有高死亡率、高残疾率的特点,存活的大部分患者中也留有不同程度的神经功能障碍,给家庭社会带来沉重的负担。目前出血性脑卒中的外科手术治疗和内科药物治疗对于出血性脑卒中的预后,尤其是脑出血后引起的功能障碍均未取得满意效果。脑出血后引起脑损伤的分子机制复杂多变,炎症反应在脑出血后脑损伤和修复中起着重要作用。小胶质细胞是脑组织中的固有存在的免疫细胞,最早的参与到脑出血后的炎症免疫反应并在脑出血的损伤修复中起关键作用。因此,调控出血性脑卒中后的小胶质细胞功能状态对脑出血的功能恢复起到重要作用。Hspd1属于编码热休克蛋白家族一员,是一个RNA结合蛋白,参与RNA代谢,同时也可能通过与其他蛋白相互作用来发挥功能。Hspd1在脑出血中的功能和分子机制尚不清楚。因此,本研究探讨Hspd1作为RNA结合蛋白在转录水平调控基因的差异表达或可变剪接参与小胶质细胞激活和对出血性脑卒中功能恢复的影响。方法本研究主要从三个层面进行研究:1.小胶质细胞Hspd1基因敲低后通过高通量测序和数据分析获得差异表达的基因和可变剪接事件;2.小胶质细胞Hspd1基因敲低后检测小胶质细胞的激活和功能状态;3.临床标本和动物实验研究Hspd1对出血性脑卒中功能恢复的影响。具体研究方法如下:1)小胶质细胞细胞分离并传代培养,利用显微镜观察小胶质细胞生长形态;2)Hspd1 sh RNA慢病毒购买于苏州Gemma公司,转染小胶质细胞培养稳定后,提取RNA及蛋白质行q RT-PCR和Western blotting鉴定Hspd1基因敲低效果;3)小胶质细胞Hspd1基因敲低成功后,细胞培养提取RNA进行RNA-seq高通量测序,数据处理分析,分析差异表达基因、可变剪接事件和功能富集分析;4)RNA-seq高通量测序,数据处理分析,对获得差异表达基因、可变剪接事件进一步行q RT-PCR验证;5)小胶质细胞Hspd1基因敲低后,细胞免疫荧光检测小胶质细胞激活类型、酶联免疫吸附试验（ELASA）检测小胶质细胞分泌的炎症因子、PCR检测M1/M2类型小胶质细胞m RNA标志物,流式细胞仪检测小胶质细胞中M1/M2所占比例;6)出血性脑卒中患者收集脑出血后96小时外周血,采集单核细胞后提取RNA,q RT-PCR检测Hspd1含量,同时评估患者脑出血3月后改良Rankin量表（m RS）评分,分析Hspd1含量与出血性脑卒中患者神经功能的相关性;7)动物模型选择成年雄性的SD大鼠,脑出血模型构建是通过立体定向仪向大鼠尾状核注射Ⅳ型胶原酶,从脑出血组织冠状位置切片、磁共振检查和神经功能学三个层次来评价脑出血模型的稳定性,脑组织切片和MRI影像学检查评价血肿的大小、位置和形态,神经功能行为学评分评估大鼠神经功能缺损的程度;8)动物模型脑出血后3小时,立体定向技术向血肿注射Hspd1 sh RNA慢病毒构建Hspd1基因敲低动物模型,Wester blotting检测Hspd1表达量,验证模型敲低效果;9)Hspd1基因敲低脑出血动物模型96小时后处死部分,用干湿重法计算脑组织含水量来评估脑组织水肿程度,组织切片评估血肿量变化以及Image J软件计算血肿量;10)Hspd1基因敲低脑出血动物模型分别在脑出血后3天、7天、14天评估大鼠的神经功能缺损及恢复情况。结果1.慢病毒敲低Hspd1基因的小胶质细胞模型构建成功,细胞状态良好,感染有效率70%以上,感染成功;2.慢病毒敲低Hspd1基因的小胶质细胞,q RT-PCR结果显示Hspd1基因敲低成功,与对照组比较Hspd1基因含量降低,WB结果与对照组比较,Hspd1蛋白表达量在实验组明显减低,差异具有统计学意义;3.小胶质细胞Hspd1基因敲低成功后,提取RNA进行RNA-seq高通量测序,数据处理分析,引起990个基因表达水平显著上调,进行GO分析富集,发现缓解脑出血血肿和脑损伤的Vim、缓解细胞凋亡和炎症反应的Mfge8、改善神经功能的Lrp1、参与血脑屏障形成的Slc2a1和发挥神经保护作用的Atf5,值得关注。发现921个基因表达水平显著下调,进行GO分析富集,发现促炎介质Hmgb2、趋化因子Ccl2、促进小胶质细胞激活的Tardbp和Ezh2、干扰素Ifi27l2a,值得关注;4.Hspd1基因敲低后发现了5231个显著差异的可变剪接事件,对发生可变剪接的基因进行GO生物学功能富集分析,根据基因可变剪接事件ratio值差异显著,同时结合文献,发现参与小胶质细胞神经炎症的Clk1、参与脑血管淀粉样变性的App、小胶质细胞炎症负调控因子Gng12、减轻脑出血脑损伤的Cast、参与神经保护的Slc38a1,值得关注;5.对本项目差异表达基因和差异可变剪接基因进行重叠分析,共发现255个基因既发生差异表达变化也发生差异可变剪接事件,其中137个基因表达上调和118个基因表达下调。对这255个基因进行GO功能富集分析,结合文献分析发现NF-κB信号通路和干扰素β信号通路与脑出血炎症反应相关,提取这两个通路富集基因的AS事件,最终挑选出Cd86、Irgm1和Mnda1;6.与对照组相比Irgm1、Cd86、Ccl2、Mndal、Ezh2基因在实验组中表达量降低,Vim、Slc2a1基因在实验组中表达量升高,且Two-way ANOVA有显著性差异,与预期一致。与对照组相比Mfge8、Lrp1基因在实验组中表达量降低,Hmgb2、Tardbp基因在实验组中表达量升高,且Two-way ANOVA有显著性差异,与预期相反。Atf5基因在实验组和对照组的表达量没有明显区别;7.与对照组相比Irgm1、Mndal基因在实验组中发生可变剪接事件的概率升高,且Two-way ANOVA有显著性差异,与预期一致;Clk1基因在实验组中发生可变剪接事件的概率降低,且Two-way ANOVA有显著性差异,与预期相反。Cd86、Gng12基因发生可变剪接事件的概率在实验组和对照组没有显著性差异;8.Hspd1基因敲低的小胶质细胞培养后呈激活状态,突起变短,胞体增大,细胞形态呈圆状或杆状,与对照组相比细胞因子IL-6、TNF-ɑ表达减少,IL-10、TGF-β表达量增加,PCR显示M1型细胞标志物CCL3、i NOS表达减少,M2型细胞标志物Arg1、Ym1表达增加,流式细胞分析显示M1型小胶质细胞比例减少,M2小胶质细胞比例增加;9.出血性脑卒中患者单核细胞中Hspd1基因表达量增加,且与脑出血患者3月后功能恢复呈负相关;10.出血性脑卒中模型构建成功,血肿位于基底节区与周围存在清楚界限,形态规则,脑出血对侧肢体出现明显功能障碍;11.Hspd1基因敲低脑出血动物模型构建成功,Hspd1表达降低;12.与对照组比较,Hspd1基因敲低脑出血动物模型脑组织水肿减轻,血肿量减少;13.Hspd1基因敲低能够促进出血性脑卒中动物模型神经功能恢复。结论RNA结合蛋白Hspd1可在转录水平调控小胶质细胞基因差异表达和可变剪接,同时抑制Hspd1表达可促进小胶质细胞向M2型激活;Hspd1表达量与出血性脑卒中预后呈负相关,抑制Hspd1表达可促进出血性脑卒中动物模型神经功能恢复,揭示抑制Hspd1表达可能通过调控小胶质细胞功能在出血性脑卒中起到神经保护作用。阐明Hspd1调控小胶质细胞在ICH治疗中的价值以及潜在分子机制,为小胶质细胞在ICH中的治疗作用提供理论支持和转化医学层面的参考,为出血性脑卒中的临床治疗提供新的可能性的治疗策略。