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小麦条锈病是威胁全球小麦生产最重要的病害之一,它是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp tritici)引起的气传真菌病害。目前种植小麦抗病品种是控制该病害最有效、经济以及对环境友好的策略。然而,由于病原菌毒力变异频繁,新的毒性小种不断产生和流行,导致大量抗病品种丧失抗性。因此寻找新的广谱、持久、稳定的抗病性基因对小麦条锈菌的可持续防控具有重要意义。非寄主抗性是植物最普遍的抗病形式,具有广谱持久的特性,不会因为病原菌的变异而丧失抗性。水稻是唯一被大面积栽种而不被锈菌侵染的禾本科作物,水稻对条锈菌的抗性即为非寄主抗性。前期本实验室利用蛋白质组学研究方法鉴定发现水稻接种小麦条锈菌后甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和甘油激酶(GK)蛋白表达差异显著。因此,本研究为明确甘油-3-磷酸代谢相关基因在水稻对条锈菌非寄主抗性作用,利用qRT-PCR、亚细胞定位等技术进行基因功能分析。借助CRISPR/Cas技术敲除靶基因,获得突变体植株。具体结果如下:(1)利用qRT-PCR分析了G3P代谢相关基因在水稻与条锈菌互作过程中的表达特征,发现3个GAPDH基因Os02g38920、Os03g03720、Os04g38600和1个GK基因Os04g55410均在小麦条锈菌侵染后表达量上升,侵染24h时表达量达到最大值。另外一个磷酸甘油酸激酶(PGK)基因Os05g41640则在小麦条锈菌侵染后呈下调表达趋势,12h时表达量达最低值。我们推测该5个候选基因可能参与了水稻对小麦条锈菌的抗病反应。(2)通过烟草瞬时表达及小麦原生质转化GFP融合蛋白实验,发现Os04g38600定位在叶绿体中,Os02g38920定位在细胞质中,Os04g55410则定位在细胞核中,而Os03g03720和Os05g41640在细胞质和叶绿体均有分布。结合进化树分析结果,可知Os02g38920属于胞质定位的GAPCs,Os04g38600和Os03g03720则属于叶绿体定位的GAPA/B。(3)构建了5个CRISPR/Cas基因编辑载体:pCAMBIA1300-Cas9-03720、pCAMBIA1300-Cas9-38600、pCAMBIA1300-Cas9-38920、pCAMBIA1300-Cas9-41640和pCAMBIA1300-Cas9-55410。利用农杆菌介导的水稻愈伤遗传转化体系,获得Os04g38600 T0代因植株118株,Os02g38920 T0代转基因植株125株,Os05g41640 T0代转基因植株123株和Os04g55410 T0代转基因植株108株。通过潮霉素磷酸转移酶和Cas9基因的特异引物检测和测序表明CRISPR-Cas9植物编辑系统可以有效的对靶基因进行编辑,编辑效率为20%-58.3%,突变方式有碱基突变、插入和缺失。(4)利用组织细胞学研究方法鉴定Os03g03720突变体T2代植株对小麦条锈菌的非寄主抗病性,结果表明,纯合突变的植株对条锈菌的抗性明显减弱,小麦条锈菌夏孢子可在水稻叶片上萌发产生芽管,进入气孔形成气孔下囊,并扩展形成一定面积的菌落。而野生型的植株对条锈菌表现为完全不亲和,杂合突变的植株相对野生型对条锈菌抗性减弱,可形成气孔下囊,并产生坏死反应。(5)通过酵母双杂交实验验证发现Os02g38920和OsATG3a能在酵母中互作,从而推测Os02g38920可能通过ATG3调控水稻细胞自噬,这为后续的实验提供了一定的研究基础。