哺乳动物卵母细胞成熟与早期胚胎发育的分子调控是生命科学研究的重要课题之一,是精细的多阶段有序调控过程。细胞骨架,尤其是微丝和微管的组装及其动态变化,是调控卵母细胞成熟和早期胚胎发育的关键；卵母细胞皮质重组与极化也是减数分裂极体排出的一个重要条件。此外,染色体的精确分离对完成减数分裂和早期胚胎发育也发挥着至关重要的作用。这一系列过程是精细的分子调控事件,任何缺陷和异常都有可能导致卵母细胞成熟或受精卵发育障碍。哺乳动物卵母细胞减数分裂和早期胚胎发育的相关分子调控机制迄今仍不十分清楚,因此,阐明卵母细胞成熟和早期胚胎发育的分子调控机制,对于揭示哺乳动物生殖规律和机理,提高家畜繁殖效率乃至治疗人类不孕不育疾病,均具有重要的理论价值。本试验以猪为研究对象,采用体外培养、药物处理、小干扰核糖核苷酸(small interfering RNA, siRNA)注射、孤雌激活、免疫荧光染色和激光共聚焦及蛋白免疫印迹(western blot)等方法,研究了调控卵母细胞成熟和早期胚胎发育的相关分子信息。首先通过免疫荧光染色法检测了KIF20A、Dynamin2、RhoA和ROCK4种蛋白在猪卵母细胞成熟或孤雌胚胎早期发育过程中的表达与定位,随后分别通过蛋白特异性抑制剂处理或核糖核苷酸干扰(RNA interference, RNAi)技术,破坏蛋白功能或抑制蛋白表达,借以研究这些蛋白对卵母细胞微丝和纺锤体组装、减数分裂纺锤体迁移与定位、皮质颗粒(cortical granule, CG)重组和分布以及染色体分离的影响,以期了解它们对猪卵母细胞极体排出与早期胚胎卵裂的调控作用。此外,用蛋白免疫印迹技术,检测GTPase Dynamin2或RhoA蛋白功能破坏后对微丝、微管相关调控蛋白表达的影响,以期进一步揭示GTPase调控猪卵母细胞减数分裂的可能信号通路,为深入了解哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育的分子调控机理奠定基础。本研究共分6个部分,主要研究结果如下：试验一、KIF20A调控猪卵母细胞减数分裂细胞周期的研究驱动蛋白样家族成员2OA (kinesin-like family member 20A, KIF20A),也被称为有丝分裂驱动蛋白样蛋白2(mitotic kinesin-like proteins 2, MKLP2),是激酶超家族蛋白中哺乳动物激酶样动力蛋白。除最初被发现参与高尔基体动力学调控外,在胞质分裂过程中,KIF20A对细胞周期的调控也是必不可少的；但迄今尚无证据表明KIF20A能调控猪卵母细胞减数分裂。因此,本试验侧重研究KIF20A是否参与猪卵母细胞的减数分裂。免疫荧光染色分析表明,在猪卵母细胞减数分裂过程中,KIF20A呈动态定位模式。生发泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)后,KIF20A位于卵母细胞的着丝粒上,在第一次减数分裂末期(telophase Ⅰ, Ⅱ),转移到卵母细胞中间体上,而在第二次减数分裂中期(metaphase Ⅱ, Mil), KIF20A又再次重新分布到着丝粒上。通过在猪卵母细胞培养体系中添加特异性的抑制剂Paprotrain,印制内源性KIF20A活性,我们进一步研究了KIF20A对减数分裂成熟的影响。试验结果显示,抑制KIF20A活性可导致第一极体(first polar body, pbⅠ)排出失败；随后通过细胞核的荧光染色检测卵母细胞所处的细胞周期,结果表明抑制KIF20A活性可影响减数分裂细胞周期,使停滞在第一次减数分裂中期(metaphase Ⅰ, MI)的卵母细胞比例增多,而发育至ATI和MII期的卵母细胞比例显著下降。我们的试验也证明,KIF20A活性抑制不影响减数分裂纺锤体的形态。本试验表明,在猪卵母细胞减数分裂过程中,KIF20A对减数分裂细胞周期的调控起关键作用。试验二、KIF20A在猪早期胚胎的分布及其对发育的调控作用驱动蛋白家族成员KIF20A是有丝分裂关键的调控因子之一,也有助于将高尔基体囊泡逆行转运至相邻的内质网。上述试验已经证明,在猪卵母细胞成熟过程中,KIF20A能够调控减数分裂细胞周期进程,本试验侧重研究其在早期胚胎卵裂过程中的作用。免疫荧光染色结果显示,KIF20A在早期胚胎中呈特异性定位,主要分布在2-、4-和8-细胞胚胎的皮质部和细胞核。KIF20A活性抑制后导致早期胚胎的卵裂阻滞,抑制剂处理组2-、4-细胞胚胎的发育率均显著下降(P<0.05)。试验结果表明,KIF20A在猪早期胚胎中表达,并调控早期胚胎卵裂过程。试验三、Large GTPase Dynamin2调控猪卵母细胞成熟的第一极体排出卵母细胞的减数分裂是一种不均等分裂过程,其调控机制和信号通路到目前为止仍然知之甚少。发动蛋白(Dynamin)家族是真核生物普遍存在的large GTPase,在细胞发育进程中调控膜泡运输和微丝相关的动态过程,但其在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的作用尚不明确。本试验探索了Dynamin2在猪卵母细胞成熟过程中的定位,功能及其调控机制。通过免疫荧光染色分析,我们观察到Dynamin2位于GV期卵母细胞皮质部,从GVBD到MII期,除皮质部定位外,Dynamin2蛋白的荧光信号也富集于减数分裂纺锤体区域。Dynamin2在卵母细胞的皮质区域的定位,与皮质微丝的定位相似。此外,与α-tubulin共定位分析也进一步证实了Dynamin2定位在减数分裂纺锤体上。特异性抑制剂dynasore印制Dynamin2活性,导致减数分裂pbI排出失败,这可能是由于减数分裂过程中微丝分布和／或纺锤体定位障碍造成的；抑制剂处理也导致了微丝帽和无皮质颗粒区域(cortical granules free domain, CGFD)形成障碍,均证实抑制Dynamin2可破坏卵母细胞极性,影响纺锤体迁移和定位。此外,Dynamin2抑制也可导致微丝成核因子ARP2在卵母细胞皮质区域的分布显著下降。本试验表明Dynamin2可通过调节ARP2在皮质部的表达,影响微丝依赖的纺锤体迁移和胞质分裂,从而调控猪卵母细胞成熟。试验四、Small GTPase RhoA在猪卵母细胞成熟过程中的表达与功能卵母细胞不均等分裂包括一系列细胞事件,并在极性建立后排出pbI。该过程主要是通过细胞骨架,包括微丝和微管来调控的。RhoA是Ras相关小GTP结合蛋白超家族Rho GTPase成员之一。活化形式的RhoA通过与其效应蛋白结合,开启其下游的信号通路,调控包括细胞极性、迁移和胞质分裂等重要细胞进程。本试验通过特异性抑制剂Rhosin或RhoA RNAi方法抑制或敲低RhoA,以期了解RhoA在猪卵母细胞减数分裂过程中的作用。免疫荧光染色结果显示,RhoA在猪卵母细胞减数分裂的各阶段均有表达,从GVBD到MII期RhoA不仅均匀分布在猪卵母细胞皮质部,也富集在减数分裂纺锤体微管上；RhoA与a-tubulin共定位分析进一步证实RhoA可与纺锤体共定位。RhoA抑制或敲低,均可导致卵丘细胞扩散抑制,pbI排出障碍及卵母细胞成熟失败。这可能是由于RhoA抑制或敲低导致微丝组装失败,影响了随后的纺锤体向皮质部迁移造成的。Western blot分析显示,RhoA参与该过程可能是通过调控微丝成核因子ROCK、p-Cofilin和ARP2/3的表达实现的。此外,RhoA抑制或敲低也可造成纺锤体形态破坏及p-MAPK表达下降,提示RhoA可能通过调控MAPK的磷酸化来调节纺锤体的组装。综合上述试验结果,我们推测small GTPase RhoA通过调节细胞骨架的动态过程参与了猪卵母细胞成熟调控。试验五、RhoA在猪早期胚胎发育过程中的表达与功能胚胎的生物发育过程是从受精卵开始的,small RhoA GTPase是细胞骨架组装,细胞极性、迁移、增殖及有丝分裂的关键调控因子。上述试验已证明其在猪卵母细胞减数分裂中的调控作用,本试验侧重探讨RhoA在猪早期胚胎发育过程中的定位与功能。RhoA在猪早期胚胎发育过程中表达,从2-细胞期至桑椹胚阶段,RhoA均分布在猪早期胚胎的皮质部,尤其富集在卵裂沟处。此外,RhoA也定位在早期胚胎的细胞核处。RhoA GTPase活性抑制,导致猪早期胚胎卵裂障碍,100μM Rhosin处理组中大部分胚胎甚至不能发育至2-细胞期。随后,细胞核的荧光染色结果显示,RhoA活性抑制后发育停滞的早期胚胎1个卵裂球细胞中出现2个细胞核,提示早期胚胎胞质分裂失败。RhoA抑制也导致早期胚胎皮质部微丝荧光强度下降,提示微丝表达减少,这可能是胚胎胞质分裂失败的主要原因。本试验表明,small RhoA GTPase通过调节微丝组装实现对胞质分裂的调控,从而影响猪早期胚胎卵裂。试验六、RhoA效应分子ROCK对猪卵母细胞成熟的调控卵母细胞减数分裂过程中,纺锤体在卵母细胞中央形成,随后迁移至皮质部,最终卵母细胞排出pbI,形成高度极化的卵子,该过程主要由微丝调控。ROCK是RhoGTPase的下游效应分子(effector),参与Rho相关细胞功能的调控,包括应力纤维的形成、细胞迁移、运动和肿瘤细胞的侵袭等,其中调控微丝骨架组装是其最关键的功能之一。本试验通过ROCK选择性特异性抑制剂Y-27632抑制内源性ROCK蛋白,探索其在猪卵母细胞成熟过程中的作用,以及调控减数分裂可能的机制。定位结果显示,从GVBD到MII期,ROCK不仅富集在纺锤体上,也定位在猪卵母细胞的皮质部。ROCK与a-tubulin 或 actin共同标记,进一步证实ROCK与减数分裂纺锤体和皮质微丝的共定位。ROCK抑制可导致猪卵母细胞成熟失败,pbI排出率显著降低。这一结果可能是由于微丝组装和微丝依赖的纺锤体迁移失败所造成的。此外,ROCK抑制也干扰了卵母细胞微丝帽和无皮质颗粒区域的形成,进一步证实卵母细胞极性破坏和减数分裂纺锤体迁移的失败。本试验提示RhoA效应分子ROCK通过调控减数分裂过程中微丝依赖的纺锤体迁移,影响pbI排出,是RhoA调控猪卵母细胞成熟过程的关键。综上所述,我们的研究分析了KIF20A、GTPase Dynamin2、RhoA及其效应分子ROCK的亚细胞定位,以及它们在猪卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的功能和调控机制,对进一步认知哺乳动物卵母细胞减数分裂和早期胚胎发育的相关分子事件及其调控过程具有重要的参考价值。