系统性红斑狼疮（SLE）是一种累及多器官、多系统,严重危害人类健康的自身免疫性疾病,其病因涉及环境、遗传易感性以及免疫失衡等多种因素。目前报道,髓系来源的抑制细胞（MDSCs）是一群未成熟和异质性的细胞群体,该群细胞通常在肿瘤、慢性炎症及肥胖等病理状态下大量累积。在小鼠中MDSCs的标志为CD11b⁺ Gr1⁺细胞,可进一步分为CD11b⁺ Ly6C^lowLy6G⁺粒细胞样MDSCs（G-MDSC）和CD11b⁺Ly6C⁺Ly6G^-单核细胞样MDSCs（M-MDSC）。虽然我们前期在MRL/1pr狼疮小鼠模型中发现MDSCs增加及其他一些研究提示MDSCs可能在SLE的发病中发挥极为重要的作用,可是,迄今对于MDSCs在SLE中所起的具体作用仍不明确。流行病学和临床资料已经证实,SLE患者表达高水平的IFN-α,且TLR7受体识别自身核酸是产生抗核抗体和IFN-α的关键步骤。但关于TLR7信号及IFN-α如何影响SLE中MDSCs的机制也不清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路已被广泛认可以控制细胞存活、代谢和增殖。一些研究表明,mTOR通路的激活可能通过影响能T细胞、B细胞、间充质干细胞（MSC）和肝细胞等促进SLE的发病。最近发现,mTOR信号的激活在感染诱发的骨髓细胞生成的过程中也起着关键作用。AMP-活化蛋白激酶（AMPK）是一种调节脂质和葡萄糖代谢的主要传感器。mTOR是AMPK的下游靶标之一,受AMPK负调控的影响。已发现二甲双胍可通过激活AMPK发挥抗炎作用,且对SLE有治疗效果。有趣的是,目前报道mTOR抑制剂INK128是一种口服、高效且选择性抑制mTORC1和mTORC2的三磷酸腺苷（ATP）竞争剂。可是,目前尚小清楚INK128是否可通过调节MDSCs影响SLE的病程。为此,在本研究中,我们以Pristane诱导的狼疮小鼠模型为研究对象,确认了 MDSCs在SLE病程中的变化;分析了 TLR7/IFN-α通过AMPK/mTOR信号途径促进MDSCs累积的作用机制。考察了 mTOR抑制剂INK128通过调节MDSCs累积对狼疮症状的缓解作用;阐述了INK128通过调控AMPK/mTOR信号通路影响MDSCs缓解狼疮症状的机制。本研究的具体结果如下:1、MDSCs的累积发生在SLE发病的早期阶段:我们检测了 Pristane诱导的狼疮小鼠模型中MDSCs的数目变化。与对照相比,在Pristane诱导的狼疮小鼠（7个月）中骨髓（BM）、外周血单核细胞（PBMC）、肾脏和脾脏中的MDSCs（CD11b⁺Gr1⁺）比例明显升高。为了进一步探究狼疮发病进程中MDSC的比例何时发生变化,我们对Pristane诱导的狼疮中MDSCs的时程变化进行了检测,发现注射Pristane 2周后,脾脏中MDSCs的比例开始增加,而Th17细胞、调节性T细胞、活化的T和B细胞直到28周才出现异常。我们还发现在Pristane诱导的狼疮小鼠的腹膜渗出液细胞（PECs）、脾脏和肾脏中IFN-α和干扰素刺激基因（ISGs）表达增加。这些结果表明,MDSCs的异常积累发生在狼疮的早期阶段,提示其可能在SLE启动阶段发挥重要作用。2.mTOR抑制剂INK128可通过调节MDSCs累积来缓解SLE症状:我们探讨了高水平表达的IFN-α与MDSCs累积的关系,发现在Pristane诱导的狼疮小鼠的腹膜渗出液细胞（PECs）、脾脏和肾脏中的IFN-α表达与MDSCs数目累积呈正相关。还发现,在BM诱导来源的MDSCs中,IFN-α刺激能显著上调TLR7。WB结果显示,在Pristane诱导的狼疮小鼠的MDSCs中,mTOR信号异常活化。TLR7激动剂R848和IFN-α可明显激活MDSCs中的mTOR信号。进一步发现,R848可以单独促进MDSCs的累积,而单独的IFN-α刺激不能够促进MDSCs积累。有趣的是,TLR7和IFN-α信号可协同促进体外MDSCs累积并且这种联合效应可以通过抑制mTOR信号来抑制。为证实mTOR途径在SLE小鼠模型中MDSCs累积中的作用,将BALB/c小鼠注射0.5ml Pristane,5个月后,将狼疮小鼠用1mg/ml INK128和rapamycin再处理2个月。与对照小鼠相比,用INK128和rapamycin处理的狼疮小鼠在BM、PBMC、肾和脾中MDSC的比例降低。在INK128处理的狼疮小鼠中,肾组织中的TLR7表达也降低。此外,INK128同时可显着抑制狼疮小鼠中PECs、脾脏和肾脏中的IFN-α和ISGs表达。INK128还可降低PECs和脾脏中MDSCs的比例及早期腹膜和肾脏对Pristane的炎症反应并降低M-MDSC依赖性IFN-α产生。为了确定INK128对SLE的治疗效果,用INK128处理Pristane诱导的狼疮小鼠2个月。与对照组狼疮小鼠相比,经过INK128治疗的狼疮小鼠的肾脏显示出对肾小球肾炎和淋巴浸润症状得到缓解;足细胞标记物WT1的表达升高;蛋白尿水平降低;脾肿大和关节肿胀和发红现象缓解;炎性浸润和骨关节中的骨侵蚀减轻;肺部炎症明显缓解。这些结果证实,INK128对Pristane诱导的狼疮具有较好治疗作用。为了进一步探讨INK128对狼疮的治疗作用是否与MDSCs的变化有关,我们删除MDSCs,发现可以改善狼疮症状,而过继转移来自狼疮小鼠的MDSCs,则可加速疾病的进展。且将mTOR抑制剂处理的MDSCs转移至狼疮小鼠时发现,狼疮症状与未治疗的MDSCs组相比症状较轻。这些结果表明INK128通过调节MDSCs的累积改善狼疮症状。3.TLR7/IFN-α可通过mTOR信号途径促进MDSCs异常调节Th17/Tregs平衡:TLR7/IFN-α—方面可通过mTOR信号促进MDSCs的累积,那么对MDSCs的功能有何影响呢?我们从脾脏中分离出MDSCs,对MDSCs的功能分子尽行检测发现,狼疮小鼠MDSCs产生的ROS的水平明显高,并且不仅与ROS产生中起重要作用的P47和GP91上调,而且与来自狼疮小鼠的MDSCs中精氨酸酶-1（Arginase-1）和iNOS的表达也明显增加。为了鉴定狼疮微环境中激活的TLR7信号和IFN-α水平如何参与MDSCs的功能改变,我们将BM来源的MDSCs用R848和IFN-α刺激24小时。发现R848可显着增加BM-MDSCs中ROS、Arginase-1和IL-1β的表达,而IFN-α则可作为辅助因子促进这一过程。有趣的是,我们发现TLR7和IFN-α在MDSCs中的协同调节作用是以mTOR信号传导依赖的方式。我们前期发现,MRL/lpr小鼠的G-MDSCs通过ROS产生而抑制Treg分化,而M-MDSCs在通过IL-1β促进Th17分化,TLR7和IFN-α处理的MDSCs可诱导产生更多的Th17细胞,而减弱产生Tregs细胞的能力。用INK128处理的MDSCs可以恢复Th17/Tregs异常平衡,且INK128对维持Th17/Treg平衡起着重要的作用。当将INK128处理的MDSCs转移至狼疮小鼠时发现异常的Th17/Treg平衡减弱。另外,与传统mTOR抑制剂Rapamycin相比,INK128在调节狼疮中异常Th17/Tregs平衡方面更为有效。在慢性炎症中,MDSCs具有分化为巨噬细胞的潜力。我们的结果显示,与对照组狼疮小鼠组相比,INK128治疗的狼疮小鼠组中肾脏中CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞的比例和炎症因子的产生显著降低。为研究在狼疮发病过程中MDSCs是否能够分化为促炎巨噬细胞以及mTOR信号是否参与了这一进程。我们用R848、IFN-α和INK128处理后,BM来源的MDSCs在含有GM-CSF的培养基中分别培养3天和5天。与对照组MDSCs相比,R848处理的MDSCs显示出更高地向F4/80⁺巨噬细胞分化能力,并且IFN-α可联合R848增强这一过程。还发现,随着mTOR信号被抑制,MDSC的分化能力也受到抑制。我们还对分析了MDSCs亚群M-MDSCs和G-MDSCs向巨噬细胞的分化,发现M-MDSCs而不是G-MDSCs是主要向巨噬细胞分化的细胞亚群。一些研究表明S100A8和S100A9蛋白直接参与抑制MDSCs成熟。我们发现TLR7和IFN-α信号通路通过mTOR途径协同降低S100A8和S100A9 mRNA表达水平。MDSCs经过R848处理后,成熟标志F4/80和MHCII表达水平明显升高。提示TLR7/IFN-α-mTOR信号在MDSCs产生炎症因子产生有明显促进作用。4.TLR7/IFN-α调节的AMPK/mTOR信号在M-MDSC和G-MDSCs的分化过程中起着重要作用:在Pristane诱导的狼疮模型中总的CD11b⁺Gr1⁺MDSCs比例明显升高,那么MDSCs的两个亚群（M-MDSCs和G-MDSCs）如何变化呢?我们发现,在Pristane诱导的狼疮小鼠骨髓、肾脏、脾脏和肺组织中M-MDSCs占整个髓系细胞（CD11b⁺细胞）的比例升高,而G-MDSCs所占比例降低。这提示我们,在狼疮发病过程中狼疮微环境的某些因素的改变可能会导致体内MDSCs两个亚群比例和功能的改变,进而影响狼疮的发病进程。在SLE发病过程中,TLR7信号处于激活状态,且TLR7的激活对总的CD11b⁺Gr1⁺MDSCs的数目增加起着至关重要的作用。对MDSCs两个亚群是否有不同的影响呢?我们在骨髓细胞向MDSCs分化的诱导体系中加入不同浓度的TLR7激动剂R848来检查其对M-MDSCs和G-MDSCs比例的影响。单独TLR7激动剂R848能够主要促进骨髓向M-MDSCs细胞分化。那么,IFN-α是否可以直接调控MDSC亚群的变化呢?我们发现单独IFN-α虽然对总的MDSCs 比例没有影响,但是对骨髓向M-MDSCs细胞亚群分化有重要调节作用。进一步发现mTOR信号对调节MDSCs两个亚群的分化是必不可少的。我们还对狼疮微环境中TLR7信号激活与IFN-α信号对M-MDSCs数目增加是否有联合作用进行了研究。我们在骨髓细胞向MDSCs分化的诱导体系中同时加入TLR7激动剂R848和IFN-α进行联合处理,处理4天后发现与单独加R848组和IFN-α组相比M-MDSCs占髓系细胞（CD11b⁺细胞）比例显著升高而G-MDSCs所占比例降低,而加入mTOR抑制剂INK128后明显抑制M-MDSCs数目的增加。这些结果表明,TLR7联合IFN-α通过mTOR信号通路可促进M-MDSCs的比例的增加。有研究报道,AMPK信号通路与mTOR信号通路之间存在负调控关系,那么AMPK信号是否在此过程中对mTOR起到中调节作用呢?我们发现,在骨髓祖细胞向M-MDSCs分化过程中,AMPK起着决定性作用,这一信号决定着细胞向M-MDSCs分化还是G-MDSCs分化。转录因子IRF-8、CEBP-β、CEBP-α、Rb1和PU1在决定骨髓祖细胞向单核细胞还是向粒细胞分化过程中起着决定性的作用。我们发现在这些转录因子中,IRF8在M-MDSCs细胞中的表达显著高于G-MDSCs的表达,其他转录因子之间差异不大。TLR7激动剂R848和IFN-α处理骨髓细胞后发现,转录因子IRF8表达明显升高,而且mTOR抑制剂INK128和AMPK信号激活剂Metformin处理后IRF8表达受到抑制。这些结果表明,TLR7/IFN-α能通过AMPK/mTOR信号通路调节转录因子IRF8的表达来决定M-MDSCs和G-MDSCs的分化命运。对体外的实验结果在Pristane诱导的SLE并发症—弥散性肺出血（DPH）小鼠模型中进行验证。我们发现,MDSCs删除后能够较为明显地缓解DPH的症状。Pristane诱导组MDSCs 比例在肺组织、骨髓、腹膜渗出液细胞和脾脏中显著升高,AMPK的激动剂Metformin和mTOR抑制剂INK128和Rapamycin治疗组MDSCs比例均有不同程度提高,这说明靶向AMPK/mTOR信号通路治疗能显著抑制总的MDSCs在狼疮DPH发病过程中的累积。并且发现Pristane诱导组MDSCs转录因子IRF8的表达水平显著升高,经过AMPK的激动剂Metformin和mTOR抑制剂INK128和Rapamycin治疗后,IRF8的表达水平均不同程度降低。这说明靶向AMPK/mTOR信号通路显著抑制狼疮样DPH模型中MDSCs中转录因子IRF8的表达进而影响MDCs的分化命运。综上所述:（1）我们确认MDSCs的累积发生在SLE发病的早期阶段;（2）发现了 mTOR抑制剂INK128能通过调节MDSCs累积来缓解SLE症状;（3）阐明了TLR7/IFN-α通过mTOR信号途径促进MDSCs异常调节Th17/Tregs平衡并促进MDSCs向促炎巨噬细胞分化与SLE密切相关;（4）揭示了 TLR7/IFN-α调节的AMPK/mTOR信号在M-MDSC和G-MDSCs的分化过程中起着重要作用。这些研究结果对于理解SLE的发病提供了重要的理论依据。