论文部分内容阅读
Bam32又名DAPP1(dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides)或PHISH(3′phosphoinositide-interacting SH2 domain containing protein),是一种淋巴细胞接头蛋白分子,主要在脊椎动物B淋巴细胞中表达。Bam32在B细胞信号转导、生发中心亲和力抗体成熟等方面都扮演着重要的作用。到目前为止,对Bam32基因的研究主要集中于哺乳动物中,在无颌类脊椎动物中是否存在Bam32以及功能如何尚无人报道。为此,我们选择以七鳃鳗为研究对象,发现与验证Bam32基因的存在以及功能,力图为深入了解无颌类脊椎动物适应性免疫系统的免疫应答机制提供一定的线索。首先通过在七鳃鳗转录组测序数据库中搜索到的一段Bam32的c DNA序列,采用3’RACE扩增技术与ORF区高保真酶扩增技术,成功的得到了日本七鳃鳗Bam32的cDNA序列的全长。日本七鳃鳗Bam32(Lja-Bam32)的O RF区包括747bp,编码含有249个氨基酸残基的蛋白质。多重序列比对分析结果显示,Bam32具有SH2(Src homology2 domain)、PH(Pleckstrin Homology)两个保守结构域和一个酪氨酸磷酸化位点。通过对不同物种的Bam32的序列进行比对,并构建了系统发育进化树,分析得到不同物种Bam32的聚类关系与它们进化上的亲缘关系一致。本研究成功构建了Bam32重组质粒,并将重组质粒转化到原核表达载体E.coli BL21菌株中,通过对以包涵体形式表达的重组蛋白进行纯化后得到纯度较高的Bam32重组蛋白。并利用重组蛋白对新西兰兔进行了免疫,成功制备了兔抗Lja-Bam32的多克隆抗体,通过ELISA法检测抗体的效价为1:32000并且通过利用Western blot方法检测重组蛋白验证了抗体的特异性。我们利用Q-PCR法对未免疫以及混合菌免疫刺激后的日本七鳃鳗Lja-Bam32 mRNA的水平进行检测,结果表明,与未免疫刺激组相比,混合菌免疫刺激后,Lja-Bam32的mRNA转录水平在单个核白细胞、鳃、髓样小体中的表达量显著上调。利用Western blot方法检测对上述免疫相关组织的蛋白样品,发现经过混合菌免疫刺激后,Lja-Bam32在单个核白细胞和髓样小体中的表达量上调显著。以上实验结果表明,Lja-Bam32可能参与了无颌类脊椎动物七鳃鳗的类淋B巴细胞的免疫应答过程。