磷是植物生长发育所需的大量元素之一,参与植物体内多种代谢过程。虽然土壤中存在大量的正磷酸盐,但由于其高反应活性大多被土壤中的金属阳离子固定成难溶磷,降低了土壤中有效磷的浓度。土壤缺磷已成为当前农业可持续发展的重要限制因素,所以提高植物从土壤中磷的吸收利用能力或寻求可替代正磷酸盐的磷肥已成为亟待解决的问题。亚磷酸盐脱氢酶存在于一些细菌中、能将亚磷酸盐氧化成正磷酸盐。若向植物中导入这种酶应该可以使其转基因植株能够直接利用亚磷酸盐磷肥。因此,本工作拟从土壤宏基因组中直接扩增到假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶Ps Ptx的基因,通过根癌农杆菌介导植物遗传转化转入烟草中,并分析其转基因烟草植株在亚磷酸盐胁迫下的特性。取得的主要结果如下:(1)Ps Ptx的基因克隆及其表达载体的构建以土壤宏基因组DNA为模板,通过定制的基因特异性引物,采用两轮PCR扩增得到全长Ps Ptx基因,然后将它克隆到p BI121一衍生载体中,构建了植物表达载体p BI121(Ps Ptx),并通过测序分析。Ps Ptx基因编码区大小为1011 bp,其推导蛋白大小为336 aa(理论分子量大小为36.5 k Da)。保守结构域预测分析表明Ps Ptx编码蛋白属于亚磷酸盐脱氢酶,含有保守的NAD+结合基序和催化功能残基;系统进化树分析显示Ps Ptx基因来源于一无法确定种名的土壤假单胞菌。另外,经IPTG诱导,Ps Ptx基因能在其重组大肠杆菌中获得高效可溶性表达。(2)Ps Ptx转基因烟草植株的获得以及PsPtx基因的表达分析将p BI121(Ps Ptx)转化到根癌农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导的烟草叶片转化法和多重PCR鉴定,获得了阳性Ps Ptx转基因烟草植株。使用Trizol法分别提取野生型烟草(WT)和3个转基因株系(Ps Ptx-3,4,8)的根、茎、叶的总RNA,并反转录成c DNA作为模板。分别用烟草18S r RNA和Ps Ptx基因特异性引物进行扩增,结果表明,Ps Ptx基因在所有转基因烟草的根、茎、叶中均有表达。(3)Ps Ptx转基因烟草植株的特性分析a.通过野生型烟草(WT)和3个转基因株系(Ps Ptx-3,4,8)在不同浓度(1m M、3 m M、5 m M)亚磷酸盐(Phi)MS培养基的胁迫实验,结果发现,亚磷酸盐胁迫下野生型烟草(WT)的根系和根上部分受到显著抑制且随着亚磷酸盐浓度的升高抑制越明显。相反,转基因烟草株系并没有受到明显的抑制,生长旺盛,积累较多的生物量。b.通过在含100 mg·L-1 Kan和含3 m M亚磷酸盐(Phi)MS培养基上野生型烟草(WT)和3个转基因株系(Ps Ptx-3,4,8)的生长情况对比,结果表明,亚磷酸盐对野生型烟草(WT)的抑制作用和Kan对野生型烟草的抑制作用大致相同,而Ps Ptx转基因植株对Kan和亚磷酸盐的抗性也几乎一致。c.在温室条件下,将Ps Ptx转基因烟草种子和野生型烟草种子按1:100的比例混合播种在含亚磷酸盐(Phi)(含量为120 mg·kg-1)的沙子和蛭石(1﹕1)混合物上生长,同样发现,野生型烟草(WT)生长受到抑制,而Ps Ptx转基因烟草能正常生长。总之,这些结果表明,Ps Ptx转基因烟草植株能利用亚磷酸盐(Phi)并将它代谢成正磷酸盐(Pi),以作为植物生长发育所需的磷源。本工作可为未来将Ps Ptx基因应用在主要农作物上或提供新的转基因筛选方法打下必要的前期基础。