寡孢节丛孢(Arthrobobrys oligospora)是一种典型的捕食线虫真菌,通过产生特殊的捕食器官-三维菌网(three-dimensional networks)来捕捉和侵染线虫,寡孢节丛孢是研究真菌与线虫相互作用的代表性菌株。钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent kinases,CaMKs)是一类重要的多功能信号蛋白,位于G蛋白信号的下游,在激素或次级信使的调控下,参与胞内信号传导,调节多种不同的生物学过程。本论文选取寡孢节丛孢为试验菌株,以5种CaMKs(CaMK A,AOL s00078g95;CaMK B,AOL s00083g485;CaMKK Cl,AOL_s00215g625;CaMKKC2,AOL_s00110g86;CaMKD,AOL_s00080g218)为研究对象,通过基因敲除、表型特征比较、环境胁迫耐受试验和荧光定量PCR等技术,初步探究了 5种CaMKs在寡孢节丛孢生长发育、环境胁迫耐受、产抱和致病过程中的功能。主要实验结果:1.CaMKs的功能结构域、理化性质和聚类分析功能结构域分析表明,5种CaMK蛋白都含有保守的protein kinase-like结构域和protein kinase结构域之外,还含有一些其它的功能位点,如丝/苏氨酸蛋白激酶活性位点(IPR008271),ATP结合位点(IPR17441)和保守的活化环(activation loop)。同时,对CaMK蛋白的理化性质分析表明,CaMKK C2的分子量较大为128.7 kDa,其余4种CaMK蛋白的分子量相对较小;而5种CaMK蛋白的等电点没有明显的差异。聚类分析表明,寡孢节丛孢中的5种CaMKs聚类形成两个不同的进化分支(Ⅰ和Ⅱ),其中Ⅰ分支为CaM kinases,Ⅱ分支为CaM kinase kinases。2.CaMKs编码基因敲除株的生长速率和环境胁迫耐受性分析构建了 CaMKs编码基因的敲除载体,运用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法,成功获得了 5种CaMKs蛋白编码基因的敲除突变菌株。然后比较敲除株与野生型菌株的生长表型特征,包括生长速率、菌落形态、抗逆性和环境胁迫耐受性(耐高温和抗紫外辐射)等。分析结果表明△CaMKs敲除株的生长速率变慢,且ACaMKK C2突变株的气生菌丝较为致密。抗逆性实验分析表明,△CaMKs敲除株的生长受到抑制,它们对不同化学试剂(如H2O2、menadione、SDS和Congo red)的敏感程度不同。环境胁迫耐受性试验结果表明,5种CaMKs在不同程度上都参与了寡孢节丛孢的耐高温和紫外应激过程。3.△CaMKs敲除株的产孢量和致病性分析与野生型菌株相比,5种△CaMKs敲除株的产孢数量均明显减少。为了进一步探讨CaMKs对产孢的调控作用,收取培养3、5和7d的敲除株和野生株的菌丝样品进行总RNA提取,再反转录为cDN△。选取了寡孢节丛孢基因组中12个与产孢相关的同源基因进行RT-PCR分析,结果表明产孢基因FlbA、FlbC、MedA、NsdD、Pka、VelB、VosA和VeA的转录水平在敲除株中都明显下调。另外,5种△CaMKs敲除株产生的捕食器官数量和杀线虫率都显著低于野生型菌株,且△CaMK B突变株产生捕食器官的时间发生了延迟。以上实验结果表明CaMKs参与了寡孢节丛孢的产孢和致病性等生物学过程的调控。本文的创新点:1.本论文首次对捕食线虫真菌的CaMKs功能进行了报道,成功敲除了寡孢节丛孢中5种CaMK蛋白的编码基因,表型特征比较表明CaMK蛋白在寡孢节丛孢中参与了多种重要的生物学过程调控,如菌丝生长、产孢、环境压力耐受、捕食器官形成和致病性等。2.比较了△CaMK 敲除株在高温条件下的表型变化,包括生长速率、孢子数量和孢子萌发率,推测CaMK蛋白参与寡孢节丛孢高温胁迫条件下的生长和产孢过程。3.比较了△CaMK 敲除株在紫外辐射下的孢子生存率变化,发现△CaMKs敲除株对紫外辐射敏感度高于野生型菌株,其中△CaMKA对紫外辐射最为敏感,说明CaMK蛋白参与了寡孢节丛孢的紫外胁迫生长调控。