研究背景和目的：终末期慢性肝病,尤其是急性肝功能衰竭,发病率及死亡率均较高。肝移植是目前确实有效的治疗手段,但由于供体器官的缺乏,仅少于30%的肝病患者可获得肝移植。肝细胞治疗可作为肝移植的替代辅助治疗,然而其局限性在于人肝细胞来源缺乏。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSC)在体外肝细胞生长因子等刺激作用下可分化为具有合成和分泌白蛋白及多种肝细胞代谢产物的肝细胞样细胞,可作为肝细胞治疗的新细胞来源。以往研究多采用平面二维细胞培养体系,诱导分化细胞呈单层生长,与体内细胞生理环境所处的三维环境显著不同。近年来,细胞三维培养方式逐渐应用于组织再生和肿瘤侵袭等领域,Ⅰ型鼠尾胶原蛋白可模拟体内细胞生长所需的细胞外基质,是最常用的三维细胞诱导体系。已有报道胚胎干细胞在胶原蛋白三维诱导体系下可分化为体内多种胚胎样组织结构,为未来器官再生研究奠定基础。肝细胞是体内高度极化的细胞。肝细胞的极化特征对于肝细胞发挥正常功能至关重要。成人BMSC在三维培养体系中能否完成向肝细胞分化,并形成肝细胞特征性的极化结构,目前尚未可知。本研究应用胶原蛋白三维培养体系将成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞,并以此为模型,深入研究肝细胞极化产生的分子基础和形态、功能特征,探讨肝细胞极化形成所需的细胞外基质条件及主要影响因素,为临床治疗由肝细胞极化紊乱引发的各种肝病提供理论基础。实验方法：一.从成人骨髓中分离出BMSC,同时利用普通平面二维细胞培养和胶原蛋白三维培养体系进行体外诱导分化培养。用倒置显微镜观察平面培养体系下诱导分化来源的肝细胞在不同时期的形态学变化。用HE染色法观察三维培养条件下分化肝细胞的形态及结构特征。用免疫荧光法观察肝细胞特异性蛋白ALB在平面培养分化来源肝细胞的特征性表达。用免疫组化法检测肝细胞特异性蛋白ALB和AFP在胶原蛋白三维诱导分化来源肝细胞的特征性表达来证实成人骨髓基质干细胞在体外诱导分化过程中肝细胞特异性标志物产生。二.用免疫荧光染色方法分别观察SRBI和BSEP等极化标志性蛋白在BMSC二维诱导分化来源肝细胞和胶原蛋白三维诱导分化来源肝细胞的特征性表达,是否形成特征性的极化结构及胆管样结构,应用小鼠肝原代细胞“三明治”培养极化模型作为阳性对照。研究结果：一.和以往研究结果一致,成人骨髓基质干细胞经平面培养诱导分化后形成成熟肝细胞特征性的多边形,方形等形态。免疫荧光染色显示在分化成熟21天后可见肝细胞特异性蛋白ALB在诱导分化来源肝细胞胞质内阳性表达。BMSC在体外胶原蛋白三维培养诱导分化体系后细胞同样具有成熟肝细胞的形态。HE染色结果显示细胞在三维培养体系内呈多层排列生长,形成细胞间紧密连接及管状结构。免疫组化染色结果显示BMSC诱导分化来源肝细胞可表达特异性蛋白ALB和AFP。二.BMSC在平面培养诱导作用下可特异的表达肝细胞极化蛋白BSEP和SRBI,但未能形成明确的特征性极化结构及胆管结构。BMSC在体外胶原蛋白三维培养诱导分化体系下不仅可特异表达肝细胞极化蛋白BSEP和SRBI,且在三维结构中可见相邻细胞形成紧密连接,从而形成特征性的极化结构和胆管结构。SRBI定位分布于面向毛细血管的基底膜面,而BSEP主要分布于面向毛细胆管的顶膜,相互连接形成特征性的毛细胆管结构,于小鼠肝原代细胞类似。研究结论：一.通过本研究,我们发现,体外三维培养诱导分化体系作用下BMSC可分化为成熟肝细胞,细胞在三维结构内早期即形成多层整齐排列,易形成球状或管腔样结构,表达肝细胞特异性蛋白。二.三维培养诱导分化体系下BMSC分化来源的肝细胞可形成特征性的极化结构和胆管结构。这一诱导培养体系为体外研究肝细胞分化和极化机制提供了良好模型。