【摘 要】
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背景视网膜色素变性77型是由REEP6基因[MIM:609346]突变引起的常染色体隐性遗传视网膜疾病。REEP6编码一种促进光感受器发育的蛋白质,通过控制内质网的转运能力参与细胞内的物质运输。目的目前已报道的与常染色体隐性RP相关的REEP6致病变异有10个,其中仅有一例来自中国。本研究旨在确定三个中国视网膜色素变性家系的致病基因变异,并进行分子生物学实验验证其致病性。方法临床资料采集:对三个独
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背景视网膜色素变性77型是由REEP6基因[MIM:609346]突变引起的常染色体隐性遗传视网膜疾病。REEP6编码一种促进光感受器发育的蛋白质,通过控制内质网的转运能力参与细胞内的物质运输。目的目前已报道的与常染色体隐性RP相关的REEP6致病变异有10个,其中仅有一例来自中国。本研究旨在确定三个中国视网膜色素变性家系的致病基因变异,并进行分子生物学实验验证其致病性。方法临床资料采集:对三个独立家系的三名先证者进行全面的眼科检查。靶向二代测序:采集先证者及其家属的静脉外周血,提取基因组DNA,使用我们自主设计的包含376个眼后段疾病相关基因的panel PS400进行高通量测序。测序数据通过XYGeneRanger2.0、TGex与EGIS分析软件,与UCSC hg19人类参考基因组序列进行比对和鉴别遗传变异。对得到的变异进行筛选,并进行Sanger测序验证。致病性分析:使用ExAC、1000G、gnomAD和dbSNP等数据库检索不同种族的目标变异频率。通过VarCards检索不同的算法对变异的致病性预测结果,包括CADD（model:GRCh38-v1.6）,Mutation Taster,SIFT,Poly Phen2,GERP++,phyloP,phastCons等。通过VarCards检索GERP、phyloP、Phast Cons和SiPhy对核苷酸保守性的预测结果。通过ClustalOmega对不同物种间的氨基酸序列进行对比。使用I-TASSER在线3D结构预测服务预测蛋白质结构。使用CDD预测保守的结构域。使用HOPE和ProtParam预测变异导致的蛋白质结构变化。使用MUpro和I-Mutant v2.0预测由变异编码的蛋白质的稳定性。变异的致病性评估依据《序列变异解读标准和指南》进行判定。体外实验:合成野生型REEP6基因,构建变异型REEP6基因,将REEP6基因连接到pcDNA3.1-HA质粒。分别用空载pcDNA3.1、pcDNA3.1-REEP6WT、pcDNA3.1-REEP6268G>C和pcDNA3.1-REEP6468delC转染HEK293T细胞。使用qRT-PCR检测各组REEP6 mRNA的表达量。进行Western Bolt检测随时间变化各组蛋白质衰减速度。进行免疫荧光实验确定各组REEP6蛋白质的定位及合成差异。结果三名先证者均被诊断为视网膜色素变性。三名先证者均表现为夜盲,管状视野,眼底呈视网膜色素变性改变。先证者A:II-3的视网膜电图（electroretinogram,ERG）反应呈熄灭型,先证者B:II-4的ERG反应明显降低。通过靶向二代测序技术,发现三位患者分别携带REEP6的一个纯合变异和两个双杂合变异,均为未报道变异,包括一个错义变异c.268G>C、一个移码缺失变异c.468delC和一个剪接变异c.598+1G>C。REEP6 c.268G>C在gnomAD数据库所有种族中的等位基因频率为0.0012,在东亚人群的等位基因频率为0.0111。REEP6 c.468delC和c.598+1G>C未在gnomAD数据库中发现。生物信息学分析表明这些变异有害,核苷酸和氨基酸序列保守。根据ACMG指南,三个变异均被定义为可能致病变异。分子生物学实验结果提示,与野生型相比,REEP6 c.268G>C和c.468delC的mRNA表达水平显著升高。REEP6 p.Vau90Leu和p.Asn156Lysfs*14引起蛋白质稳定性下降,半衰期缩短。免疫荧光显示REEP6 p.Vau90Leu和p.Asn156Lysfs*14在HEK293T细胞中形成了无功能的蛋白包涵体。结论本研究在3个中国RP家系中发现了3个REEP6基因新变异,包括一个错义变异c.268G>C、一个移码变异c.468delC和一个剪接变异c.598+1G>C。根据ACMG指南,这3个变异均为可能致病变异。REEP6 c.268G>C和c.468delC导致蛋白质稳定性下降。免疫荧光显示REEP6 c.268G>C和c.468delC在HEK293T细胞内形成了无功能的蛋白包涵体。
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