钙网蛋白（Calreticulin CRT）是一个分子量大小为46kDa的钙结合伴侣分子，位于内质网内。钙网蛋白主要有N，P和C三个结构域构成。P和C结构域通过结合Ca2+来维持细胞内Ca2+的平衡，而钙网蛋白分子伴侣的功能则是通过N结构域的凝集素结合序列，保证蛋白质合成的正确折叠。　　大量的文献表明，钙网蛋白与肿瘤的发生发展关系密切，不仅在肿瘤组织高表达，还能促进肿瘤的生长和转移。但表达在细胞膜表面的钙网蛋白却能促进免疫系统的清除作用。在本实验室的前期研究工作中构建了表达膜型CRT/39-272慢病毒载体，以小鼠黑色素瘤细胞株（B16）为载体，感染筛选出能稳定表达膜型CRT的稳转细胞株。本课题以此细胞株为载体研究肿瘤微环境中的膜型CRT对肿瘤发生发展的免疫学作用及其机制，为更全面地研究CRT在肿瘤发生发展中的作用提供新的立足点。　　本课题首先在体外观察肿瘤细胞自身表达在细胞膜上的CRT蛋白对B16细胞增殖、迁移和粘附的影响，来研究膜型CRT蛋白对肿瘤细胞自身特性的影响。发现B16-tmCRT和B16-EGFP稳转细胞体外的增殖、粘附以及迁移能力没有区别。然后在体内通过构建小鼠肿瘤模型，来观察肿瘤细胞自身表达的膜型CRT蛋白对B16在小鼠体内成瘤性的影响。结果显示B16-tmCRT细胞的成瘤性强于B16-EGFP细胞。进一步分析这两组荷瘤小鼠的脾脏、血液以及肿瘤组织局部的免疫细胞比例，我们发现树突状细胞（DC）、骨髓来源的抑制细胞（MDSC）、自然杀伤细胞（NK）和T细胞的比例没有明显差异。但在B16-EGFP荷瘤小鼠中，巨噬细胞的比例出现明显的富集。提示B16-tmCRT细胞的强成瘤性与巨噬细胞有关。为了进一步验证B16-tmCRT细胞的强成瘤性是否是与巨噬细胞有关，我们使用clodronate liposomes这种靶向性的巨噬细胞清除剂清除小鼠体内的巨噬细胞。在去除巨噬细胞的同时给小鼠接种B16-tmCRT以及B16-EGFP细胞，观察其成瘤能力。发现在清除小鼠体内巨噬细胞之后，B16-tmCRT组的成瘤能力明显下降，与B16-tmCRT组的成瘤能力没有明显差异。而检测荷瘤小鼠体内的免疫细胞比例，发现在肿瘤处，B16-tmCRT荷瘤小鼠富集了更多的M2型巨噬细胞。对肿瘤切片，通过免疫荧光进一步证明了这个结果。结果说明B16-tmCRT细胞的强成瘤性与M2型巨噬细胞相关。　　为了观察巨噬细胞是如何与B16-tmCRT细胞作用的，我们取小鼠的骨髓细胞，使用M-CSF将其诱导成巨噬细胞，与B16-tmCRT共培养。结果显示，巨噬细胞能吞噬更多的B16-tmCRT细胞，同时B16-tmCRT还能增强巨噬细胞的吞噬能力。　　我们又考察了将小鼠的骨髓细胞与B16-tmCRT和B16-EGFP细胞共培养时，B16-tmCRT细胞对骨髓细胞分化方向的影响。发现在分化过程中，B16-tmCRT细胞能促进巨噬细胞的表型向M2型分化。　　综上所述，表达在细胞膜表面的CRT蛋白在前期会诱导机体的一个强免疫反应，引发巨噬细胞对肿瘤的清除。但在复杂的肿瘤微环境中，膜型CRT反而促进巨噬细胞向M2方向极化，从而导致B16-tmCRT荷瘤小鼠的肿瘤大于B16-EGFP荷瘤小鼠。膜型CRT促进巨噬细胞分化的具体机制还须进一步研究，有望为肿瘤治疗提供新的思路。