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背景泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径,负责降解80%以上的细胞内错误折叠蛋白或其他突变蛋白。泛素(Ubiquitin,Ub)与底物的结合称作泛素化(ubiquitination),是由泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)的连续作用催化泛素自身的不同位置lysine(K)和底物结合完成的。Ub-K48连接的泛素化通常将底物导向蛋白酶体依赖降解,而Ub-K63连接的泛素化则主要具有调节信号通路、内吞作用和蛋白质相互作用的功能。蛋白质泛素化在多种神经退行性疾病中具有重要意义。而衰老和帕金森氏病均引起泛素蛋白酶体系统功能异常,研究表明多巴胺能神经元随着衰老和帕金森氏病均出现丢失现象,其机制与泛素蛋白酶体系统密切相关,但是Ub-K 48和Ub-K 63结合物在多巴胺能神经元内的表达及其与衰老的关系尚不清楚。目的本课题研究在小鼠黑质多巴胺神经元内Ub-K48和Ub-K63结合物的表达情况及其与衰老的关系,旨在为防治帕金森疾病寻找新的靶点和思路。方法将12只5周龄C57BL6雄性小鼠和6只13月龄C57BL6雄性小鼠分为两组处理,其中6只5周龄C57BL6雄性小鼠和3只13月龄C57BL6雄性小鼠进行多聚甲醛心脏灌注,石蜡包埋。运用组织免疫组化SP法检测Ub-K48、Ub-K63以及TH的表达情况,运用组织免疫荧光技术检测Ub-K48、Ub-K63与TH的共表达情况。另外6只5周龄C57BL6雄性小鼠和3只13月龄C57BL6雄性小鼠进行生理盐水心脏灌注,提取中脑黑质部位与中脑上端部位,运用免疫蛋白印迹实验检测Ub-K48、Ub-K63、TH蛋白的表达情况。结果1.组织免疫荧光结果显示在5周龄C57BL6小鼠的中脑黑质部位,Ub-K48和Ub-K63结合物在多巴胺神经元内的阳性率明显高于非多巴胺神经元细胞,并且Ub-K63平均荧光强度明显高于Ub-K48。2.免疫组化结果显示5周龄C57BL6小鼠中脑黑质部位Ub-K63阳性率高于Ub-K48。Ub-K48和Ub-K63都集中分布在黑质的致密部部位和腹侧被盖区。3.组织免疫荧光结果显示在13月龄小鼠黑质多巴胺神经元胞质内可见Ub-K48泛素聚集,与TH蛋白有共聚集现象。5周龄小鼠黑质多巴胺神经元胞质内可见Ub-K63泛素聚集,但与TH蛋白无共聚集现象。13月龄小鼠大脑多巴胺神经元胞质出现明显Ub-K63泛素聚集,与TH蛋白有共聚集现象。4.免疫印迹实验结果显示,而随着小鼠的衰老,中脑黑质部位TH表达减少。13月龄小鼠的中脑上端部位和黑质部位在130k Da分子量附近均出现高分子量Ub-K48泛素结合物。对比5周龄小鼠黑质部位,13月龄小鼠黑质出现更多Ub-K48泛素结合物。13月龄小鼠的中脑上端部位和黑质部位在130k Da分子量附近也出现少量高分子量Ub-K63泛素结合物。结论1.在5周龄小鼠中,Ub-K63和Ub-K48在多巴胺能神经元中集中表达,主要在黑质致密部(SNC)和腹侧被盖区(VTA)。2.与Ub-K48相比,在多巴胺能神经元中发现更多的Ub-K63。3.在13月龄小鼠的多巴胺神经元中发现Ub-K63和Ub-K48连接物,并与TH共聚集,其中UB-K48的聚集物增加更显著。