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鹅膏菌属（Amanita）毒蕈原浆汁毒素根据其结构、性质主要分为鹅膏毒肽（amatoxins）、鬼笔毒肽（phallotoxins）和毒伞素（virotoxins）三类。这些毒肽都是环化小分子，化学性质稳定，具有极高的应用与研究价值，α-amanitin是其中含量最高的有毒多肽之一。它们在真核生物mRNA合成的专一性抑制、基因的组织结构和细胞定位、基因的表达与调控、细胞膜转运系统、细胞结构与功能、肿瘤和病毒的研究等领域具有广阔的应用前景。但是毒蕈资源有限，都是从野生子实体中分离获得，且不易分离纯化，所以现今的各类毒肽产品全部来自于欧美，价格昂贵。这大大限制了国内科研人员对毒肽的研究和利用。 利用反相HPLC和紫外吸收光谱分析从四川三江地区采集到的鳞柄白毒鹅膏菌（Amanita virosa）。鳞柄白毒鹅膏菌子实体H2O抽提液在以0.02mol/L醋酸铵—乙腈为流动项的梯度洗脱模式下的RP-HPLC条件下，α-amanitin出峰时间约为12.22min，比较洗脱峰与α-amanitin标样浓度制成标准曲线（线性回归方程是Y=5159X+1097.4），发现鳞柄白毒鹅膏菌中α-amanitin的含量约为2838.8ug/g干子实体。 Zanotti G．等人尝试通过化学的方法先合成一种鹅膏毒肽（amaninamide）的线性骨架，然后环化生成活性毒肽，以期解决资源的问题，但是程序复杂，成本高昂。通过构建含α-amanitin八肽碳骨架编码序列融合基因的表达载体，在适宜条件下高效表达，生成的线性碳骨架可为化学合成和修饰提供前体物质基础，供进一步环化研究，也可以以前体物质的形式加入到人工培养的产α-amanitin的菌丝体培养基中，刺激其提高活性α-amanitin的产量。论文利用加端PCR技术来构建该表达载体，将两次连续加端PCR反应的产物连入表达载体pGEX-1λT，得到含α-amanitin线性八肽碳骨架编码序列的阳性重组子四川大学博士学位论文pGAT一1。测序结果显示，构建的GST一AT融合基因相位正确，阅读框通读。通过对融合基因在大肠杆菌中表达条件的优化，目的融合蛋白的表达量可提高33.5%，占总蛋白表达量的28.3%。这为利用化学手段环化a一am耐tin线性前体以及通过培养毒覃菌丝体生产活性a一amanitin的进一步研究提供了碳骨架来源，有助于对活性a一am耐tin的研究与生产。 通过对a一am耐tin致小鼠中毒机理研究发现，a一am丽tin腹腔和尾静脉注射 （给药剂量范围分别是0.6一o.gm叭g和0.25一o.45m叭g）两种给药方式下，小鼠死亡事件主要发生在给药后24h一60h时间段，小鼠死亡率概率变换值对给药浓度对数变换值存在回归关系，直线回归方程分别为户=0.0404x一0.1297（RZ一0.9662）和夕=o.o933x一0.4878（R2一0.9625），半致死计量分别为0 .742mg/kg和0.327mg/kg。 尾静脉给药与腹腔注射相比，a一am耐tin作用的起效时间更快，强度更高，说明中毒症状、死亡率与高水平的血药浓度有关。a一amhatin中毒会引起小鼠严重的肠胃炎反应和小鼠体重的急剧降低。在尾静脉给药12一%h时间段，白细胞计数、红细胞计数和血红蛋白浓度也显著降低。其中WBC小细胞计数变化趋势与白细胞计数变化趋势相似，而WBC大细胞计数在尾静脉给药12h后，就一直显著性降低，占白细胞总数的比例持续降低。血清中BLJ’N、Crea在给药12h后明显升高。24h后，ALT、AST含量分别为1308.5士109.8lU几和898.0士z97.99U/L，升高了24.0和9.64倍;TBIL、DBIL含量分别为24.21士8、49林mol几和17.74士7.25林mo比，升高了26.3、40.0倍。TP、GLOB含量在给药84h后显著下降，Alb含量在给药120h后显著下降。中毒小鼠在48h后，肝脏和肾脏的脏器指数升高。解剖和病理学研究发现，肝脏、肾脏病变严重;超微结构观察结果显示，细胞核和线粒体是敏感的细胞器。利用反相HPLC技术分析动物组织样品中a一am而tin的实验发现，尾静脉给药48h后，血浆和脾脏中不易检测到a一am耐tin的存在，而在肝脏和肾脏中可以检测到其存在。 运用MTT法研究不同浓度的a一amanitin和不同作用时间对体外传代培养的人正常肝细胞（Chang细胞株）和肝癌细胞（sc一7721细胞株）存活率的影响。研究发现，二一amanitin的使用剂量与细胞CSR存在一定关系，随着剂量的增加，细胞esR逐渐降低。7.12xlo一’omrnoFLa一amanitin作用于两种细胞24h后，就能显著抑制细胞的生长。l二四川大学博士学位论文 对Chang和sc一7721细胞CSR平方根的反正弦值与a一am耐tin浓度的对数变换值进行相关和回归分析，发现它们在a=0.05水平，双尾检验呈显著性相关;对它们进行曲线拟合，结果显示线性模型拟合最好，线性回归方程分别为Y=56.3939一1 .4824x和Y=54.7296一1 .7849x。比较由回归方程外推得到的a一am二tin对实验用两种细胞株的IC50值和小鼠半致死剂量，两者在数量级上的明显差异说明动物体较之体外培养细胞对a一am树tin更为敏感。 a一amanitin对Chang和sc一7721细胞株的毒性作用与cy的作用相比较，发现7.12XIO碑OFLa一amanitin对这两种细胞株的抑制率分别为，其毒性作用略强与10ol/L cy;而7.12xlo一’20比a一am丽tin对细胞的作用效果与2.smmol几CY相近，分别为91.55%和93.43%。两种药品对Chang、srnme一7721?