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目的:LncRNA(Long non-coding RNA,长链非编码RNA)是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子,普遍存在于哺乳动物基因组中。大量Lnc RNA参与基因表达调控、细胞分化以及癌细胞的转移等多种生物学过程。Plnc1是一种新型Lnc RNA,由小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因的上游约25000bp的位置处转录而来,前期基因芯片分析证实,其在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂分化过程中表达增加。因此,本研究旨在分析确定Plnc1在BMSCs成脂分化过程中的作用及可能的分子机制。方法:一、检测Plnc1在小鼠不同组织中的分布情况准备八周龄C57BL/6J正常小鼠、ob/ob肥胖小鼠和KKAy肥胖小鼠,分离正常小鼠的不同组织(包括脑、心脏、肺、肝、肾、骨骼肌、附睾脂肪、腹股沟脂肪、肾周脂肪和棕色脂肪组织)以及肥胖小鼠的不同部位脂肪组织(包括附睾脂肪、腹股沟脂肪和肾周脂肪组织),通过RT-q PCR方法检测Plnc1在正常小鼠不同组织中以及肥胖小鼠脂肪组织中的表达水平。二、Plnc1调控小鼠BMSCs成脂分化的功能研究1.培养骨髓基质细胞(ST2细胞)并进行成脂诱导分化,收取不同时间点细胞,经油红O染色以及OD520的检测来观察细胞成脂分化情况,通过RT-q PCR方法从m RNA水平检测Plnc1基因的表达水平和成脂分化标志性基因a P2、相关转录因子PPARγ的表达水平。2.构建Plnc1过表达质粒,并设计合成Plnc1 si RNA,通过功能获得性实验将Plnc1过表达质粒转染ST2细胞以及功能缺失实验将Plnc1 si RNA转染ST2细胞,成脂分化诱导后,通过油红O染色技术检测Plnc1的表达在ST2细胞成脂分化过程中发挥的调控作用;并通过RT-q PCR和Western blotting的方法分别从m RNA水平和蛋白水平检测成脂分化相关转录因子PPARγ及C/EBPα和标志基因a P2的表达。3.分离六周龄C57BL/6J小鼠原代BMSCs,并包装Plnc1过表达和敲减慢病毒,然后,慢病毒感染原代BMSCs,并进行成脂诱导分化。接着,按照上述同样的方法检测Plnc1的表达在小鼠BMSCs成脂分化过程中的调控作用。三、Plnc1在体外调控小鼠BMSCs成脂分化的分子机制1.将PPARγ1和PPARγ2启动子构建体同Plnc1过表达质粒或Plnc1 si RNA共转染小鼠前脂肪细胞(3T3-L1细胞),然后,通过双荧光素酶检测确定Plnc1是否主要通过调节PPARγ2在脂肪细胞分化中发挥其功能。2.进行功能获得性和缺失实验,将Plnc1过表达质粒和Plnc1 si RNA分别转染3T3-L1细胞,通过MSP方法(甲基化特异性聚合酶链反应)检测Plnc1的表达是否影响PPARγ2启动子的甲基化水平。3.在成脂诱导和非诱导状态下将Plnc1过表达质粒和甲基化或非甲基化的PPARγ2启动子构建体转染3T3-L1细胞,然后,通过双荧光素酶检测确定Plnc1对PPARγ2启动子转录活性的影响。结果:一、Plnc1在小鼠不同组织中的分布情况Plnc1在脂肪组织中大量表达,并在肥胖小鼠中上调。Plnc1在正常小鼠的附睾脂肪和腹股沟脂肪组织中呈高表达,在肾周脂肪和脑组织中呈中等表达,在心脏、肝、肺、肾、骨骼肌和棕色脂肪组织中呈低表达。Plnc1在肥胖小鼠的脂肪组织中的表达水平较正常小鼠脂肪组织增高。二、Plnc1调控小鼠间充质干细胞成脂分化的功能研究1.在脂肪细胞形成过程中,Plnc1的表达上调。在ST2细胞的成脂分化过程中检测Plnc1的表达,RT-q PCR检测结果显示,成脂诱导分化后,成脂分化相关转录因子PPARγ和标志基因a P2的表达先上调后下调;在成脂分化过程中所有指定时间点,Plnc1的表达水平也先上升后下降。2.Plnc1过表达促进脂肪细胞分化。通过功能获得性实验证实Plnc1在ST2细胞和小鼠BMSCs成脂分化过程中作用。在成脂诱导分化条件下,Plnc1促进脂肪细胞的形成;相应的,成脂分化相关转录因子PPARγ及C/EBPα,标志基因a P2的m RNA和蛋白水平升高。3.Plnc1敲减抑制脂肪细胞的形成。通过功能缺失实验进一步证实Plnc1在ST2细胞和小鼠BMSCs成脂分化过程中作用。成脂诱导分化后,抑制内源性Plnc1的表达抑制脂肪细胞的形成;RT-q PCR和Western blotting检测结果进一步证实Plnc1 si RNA和Plnc1敲减慢病毒降低PPARγ,C/EBPα和a P2的表达水平。三、Plnc1调控小鼠BMSCs成脂分化的分子机制Plnc1抑制PPARγ2启动子的甲基化并促进其转录活性。在未成脂诱导分化和成脂诱导分化的3T3-L1细胞中,Plnc1敲低比PPARγ1启动子更能抑制PPARγ2启动子的转录活性。相反的,Plnc1过表达比PPARγ1启动子更能促进PPARγ2启动子的活性。此外,Plnc1 si RNA导致PPARγ2启动子的甲基化水平提高,而Plnc1过表达导致PPARγ2启动子的甲基化水平降低。下一步的研究表明,Plnc1的过表达在非甲基化和甲基化状态下进一步增加了PPARγ2启动子的活性。结论:1.Plnc1在正常小鼠不同组织中表达存在差异,在脂肪组织中呈高表达;而肥胖ob/ob和KKAy小鼠较非肥胖对照小鼠的脂肪组织中Plnc1基因的表达水平明显上调。2.Plnc1在脂肪细胞形成过程中表达水平明显上调,并且在细胞成脂分化过程中发挥促进作用。3.Plnc1通过减弱启动子的甲基化状态来增强PPARγ2的启动子活性,从而促进PPARγ2的转录。