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目的旨在建立新西兰兔膝关节软骨缺损模型,利用深低温技术制备的同种异体骨支架材料复合BMP-4和SMSCs,实现关节软骨损伤的有效修复,从而揭示软骨修复规律,以期为软骨损伤修复提供新思路。方法1.兔SMSCs获得与制备:新西兰兔膝关节腔取材,用Ⅰ型胶原酶消化分离获取SMSCs,采用流式细胞技术检测标记物。设置梯度MOI的病毒(Ad-BMP-4)感染SMSCs,检测转染效率和细胞生长曲线,ELISA检测SMSCs相关蛋白表达。2.同种异体骨移植物的构建和处理:18只成年新西兰兔,使用横穿钉套筒钻取股骨关节面软骨柱36个,软骨柱逐级降温后放入液氮罐中冻存3w。3.软骨缺损动物模型的建立和干预:24只成年新西兰兔随机分成4组,使用横穿钉套筒在股骨髁关节面造成直径4 mm、深度大于4 mm的全厚关节软骨缺损模型。A组为单纯软骨缺损模型,B组使用单纯同种异体骨修复,C组使用SMSCs复合同种异体骨修复,D组使用BMP-4转染的SMSCs复合同种异体骨修复。4.修复效果的评估:术后4、8和16w时间点对4组动物关节取材,每组2只4膝,标本固定切片处理后进行病理学染色,参考Wakitani组织学评分系统从修复组织的细胞种类、基质染色、表面平整、软骨厚度及与周围正常软骨组织的整合情况综合评估缺损修复状况。结果1.经分离纯化获取的SMSCs形态学表现出间充质干细胞应有的结构,流式细胞术检测SMSCs表面标记CD44、CD90高度表达,CD34基本不表达,符合SMSCs的特征。感染效率依赖MOI高低,结合生长曲线选取300MOI为合适的感染滴度。经ELISA检测重组腺病毒感染兔SMSCs细胞,能维持细胞正常增殖水平,且能快速高效地表达BMP-4,并激活其他软骨相关基因Sox9、COLⅡ等表达,促使SMSCs向软骨细胞分化。2.BMP-4基因修饰的SMSCs复合同种异体骨用于兔关节软骨修复,实验组在各个时间点修复组织表面的平整度、与周围软骨整合度均优于其他对照组。病理切片染色,实验组HE和Safranin O染色可见增多的细胞外基质和软骨细胞凹陷,免疫组化染色可见明显的Ⅱ型胶原强阳性表达。结论携带BMP-4基因的腺病毒在成功感染SMSCs后对SMSCs向成软骨分化起重要作用,具有促进SMSCs向软骨分化的能力。经BMP-4基因转染的SMSCs复合同种异体骨可促进损伤的兔膝关节软骨修复,为今后SMSCs复合载体进行软骨组织工程修复的实验研究提供了新的思路。