第一部分家族性激素耐药型肾病综合征家系NPHS2基因的分析 目的:原发性肾病综合征(PNS)是儿童最常见的肾小球疾病，临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和不同程度的浮肿。大部分PNS患儿对激素敏感，预后良好；然而，10％～20％PNS患儿对激素耐药，大部分将逐渐进展到终末肾。近年来，关于肾病综合征(NS)激素耐药的发生机制研究在单基因突变引起激素耐药型肾病综合征(SRNS)方面取得了突破性进展，中国汉族人家族性SRNS是否存在NPHS2基因突变及其特点均不清楚。本研究通过对一个中国汉族人家族性SRNS家系NPHS2基因突变的检测，旨在分析中国汉族人家族性SRNS家系NPHS2基因及其突变特点。 结论: 1、本研究首次发现中国汉族人家族性SRNS家系有一个NPHS2基因复合杂合突变，该结果表明我国家族性SRNS确实存在NPHS2基因突变，因此，我国对于具有NS家族史的SRNS患者应该进行NPHS2基因突变分析。 2、503G＞A为新发现的NPHS2基因突变。 3、理论上NPHS2基因467_468insT与503G＞A复合杂合突变将影响编码蛋白podocin的羧基端，然而抗podocin氨基端重组蛋白抗体P21染色却阴性、抗podocin羧基端重组蛋白抗体P35染色显示弱阳性，与理论推测结果不同。 第二部分散发性激素耐药型肾病综合征患儿NPHS2基因的分析 目的:PNS是儿童最常见的肾小球疾病，临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和不同程度的浮肿。大部分PNS患儿对激素敏感，预后良好；然而，10％～20％PNS患儿对激素耐药，大部分将逐渐进展到终末肾。本研究通过对23例散发性SRNS中国儿童进行NPHS2基因突变的检测，旨在分析散发性SRNS中国儿童NPHS2基因及其突变特点。 结论: 1、本研究首次证实了中国儿童散发性SRNS确实存在NPHS2基因突变，其突变发生率为4.3％(1/23)，表明在我国对发病年龄小于16岁的散发性SRNS患儿要考虑有NPHS2基因突变的可能。 2、1082T＞C为新发现的NPHS2基因突变。 3、新发现并确定了NPHS2基因3个多态性：-51G＞T、IVS3-46C＞T和IVS3-21C＞T。 4、-51G＞T、288C＞T、IVS3-46C＞T、IVS3-21C＞T、IVS7-74G＞C、954T＞C和1038A＞G7种NPHS2基因多态性可能与中国儿童发生SRNS无关。 第三部分突变NPHS2基因在真核细胞中的表达 目的:NPHS2基因突变引起常染色体隐性遗传型SRNS。为了解释先证者肾组织与抗podocin氨基端和羧基端抗体的间接免疫荧光染色与NPHS2基因突变位点不一致的现象，进行了突变NPHS2基因在真核细胞中的表达研究。 结论: 1、本研究成功地构建了含有野生型NPHS2基因编码区全长cDNA、分别含有467_468insT突变和503G＞A突变的NPHS2基因编码区全长cDNA的表达载体，而且应用这三种表达载体分别成功地转染了HEK293细胞。 2、抗podocin氨基端及羧基端多克隆抗体P21、P35免疫荧光染色及双标记显示：分别含有467_468insT和503G＞A突变的NPHS2基因表达的podocin均分布在细胞核周，不能正常到达细胞膜，支持467_468insT和503G＞A突变的致病性。 3、通过应用抗podocin氨基端和羧基端抗体与患者肾组织、与突变体表达产物结合结果的分析，更表明蛋白质表达过程以及调控机制是非常复杂的。 第四部分激素耐药型肾病综合征儿童糖皮质激素受体基因的检测和分析 目的:PNS是儿童最常见的肾小球疾病，临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高胆固醇血症和不同程度的浮肿。大部分PNS患儿对激素敏感，预后良好；然而，10％～20％PNS患儿对激素耐药，大部分将逐渐进展到终末肾。 结论: 1、具有NR3C1基因单倍体3和单倍体5的NS儿童发生激素耐药的危险分别是不具有单倍体3和单倍体5的NS儿童的4.824倍、2.469倍，但NR3C1基因单倍体3和单倍体5与NS激素耐药之间的相关性尚须进一步证实。 2、成功地建立了检测NS儿童外周血单个核细胞NR3C1基因mRNA表达的RT-PCR方法。