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目的：本实验室前期研究已表明姜黄素可以改善gp120 V3环所致学习记忆障碍大鼠的行为学功能、降低脑内氧化性损伤产物,促进学习记忆相关蛋白的表达并提高学习记忆能力。本实验在此基础上,从原代大鼠海马神经元、海马突触体和海马脑片三个层面,观察姜黄素对gp120 V3环所致大鼠海马神经元突触损伤的保护作用,并探讨姜黄素对gp120 V3环所致大鼠海马神经元突触损伤的保护作用机制,旨在为姜黄素防治HIV相关认知障碍(HIV-associated neurocognitive disorders, HAND)提供实验依据。方法：1.采用无血清培养法培养大鼠海马神经元,经免疫荧光法进行纯度鉴定。MTT法确定姜黄素神经保护性剂量和gp120 V3环损伤神经元突触但未对存活率发生影响的低毒剂量,模拟HAND神经元早期的病理特征,并采用L-型Ca2+通道阻断剂尼莫地平,将实验分为对照组、姜黄素组、尼莫地平组、gp120 V3环组、姜黄素+gp120 V3环组和尼莫地平+gp120 V3环组。2.1μmol／L姜黄素或10μmol/L尼莫地平单独或分别与1nmol/L gp120 V3环共同作用于原代培养大鼠海马神经元4h后,免疫荧光法观察各组神经元突触生长情况,全细胞膜片钳记录各组神经元L-型Ca2+通道电流大小,Fura-2／AM钙离子探针检测各组神经元内Ca2+浓度,评价各组药物对大鼠海马神经元突触形态及L-型Ca2+通道的影响；3.1μmol／L姜黄素或10μmol/L尼莫地平单独或分别与1nmol/L gp120 V3环共同作用于原代培养大鼠海马神经元24h后,通过JC-1试剂盒检测线粒体膜电位、Hoechst33258观察细胞核形态变化及Real-Time PCR检测Bcl-2、Bax、caspase-3基因表达,进一步评估各组药物对突触损伤后神经元凋亡的影响；4.制备离体大鼠海马脑片,1μmol/L姜黄素或10μmol／L尼莫地平单独或分别与1nmol／L gp120 V3环共同作用于大鼠海马脑片1h后,采用细胞外微电极记录技术,分别记录Schaffer侧支-CA1区神经元的输入／输出曲线(input-output curve, I/O curve)、场兴奋性突触后电位(field-excitatory postsynaptic potential, fEPSP)、长时程增强(long-term potentiation, LTP)和双脉冲易化(paired-pulse facilitation, PPF),观察各组大鼠海马CA1区神经元突触的基本传递、突触前膜释放和突触后膜敏感性、突触可塑性及突触前膜效应,评价各组药物对大鼠海马神经元突触功能的影响；5.提取大鼠海马突触体,1μmol／L姜黄素或10μmol／L尼莫地平单独或分别与1nmol／Lgp120 V3环共同作用于大鼠海马突触体30min后, Fura-2／AM钙离子探针检测各组突触体内Ca2+浓度,透射电镜观察各组突触体形态变化,评价各组药物对大鼠海马突触体内Ca2+浓度及显微形态的影响。结果：1.经免疫荧光法鉴定,本实验培养神经元纯度在90%以上,纯度高、活性好。1μmol／L姜黄素在48h内对细胞的存活率无明显影响(P>0.05 vs control),2μmol/L姜黄素作用6h以及更高浓度,显著抑制细胞存活率(P<0.05 vs control),因此采用1μmol／L姜黄素作用4h用于观察其保护作用；gp120 V3环对大鼠海马神经元的毒性具有时间依赖性,其中各浓度gp120 V3环在作用2-8h范围内对细胞存活率无明显影响(P>0.05 vs control),在作用12h后细胞存活率降低,差异显著(P<0.05 vs control), 1nmol/L gp120 V3环作用24h后细胞存活率降低为85.32±2.85%,因此采用1nmol/L gp120 V3环作用4h观察其对大鼠海马神经元突触损伤的作用,作用24h观察突触损伤后的凋亡情况。并参照文献选择10μmol／L尼莫地平,观察阻断L-型Ca2+通道后,gp120 V3环对大鼠海马神经元突触的影响。2.gp120 V3环可显著抑制神经元突触生长,L-型Ca2+通道电流增加,细胞内Ca2+浓度升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05 vs control);姜黄素与尼莫地平可改善gp120 V3环对大鼠海马神经元突触生长的抑制作用,抑制L-型Ca2+通道活性,降低由gp120V3环引起的细胞内升高的Ca2+浓度(P<0.05 vs gp120 V3 loop);姜黄素与尼莫地平单独作用对神经元突触生长、L-Ca2+通道电流峰值及细胞内Ca2+浓度无显著影响(P>0.05 vs control)。3.gp120 V3环可降低大鼠海马神经元线粒体膜电位,引起细胞核固缩、核碎裂,Bcl-2表达下降,Bax及caspase-3表达升高,促进细胞凋亡(P<0.05 vs control);尼莫地平与姜黄素则可抑制gp120 V3环引起的大鼠海马神经元线粒体膜电位降低,改善细胞核固缩,促进Bcl-2基因表达上升、Bax及caspase-3基因表达下降,抑制神经元凋亡(P<0.05 vs gp120 V3 loop);姜黄素与尼莫地平单独作用对神经元线粒体膜电位、细胞核形态及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3的表达无影响(P>0.05 vs control)。4.各组药物对大鼠海马CA1区神经元突触的基本传递、突触前膜效应未产生明显影响(P>0.05 vs control),但gp120 V3环可显著抑制LTP的诱发,抑制神经元突触可塑性(P<0.05 vs control);尼莫地平与姜黄素可拮抗gp120 V3环对海马脑片LTP的抑制作用,改善神经元突触可塑性(P<0.05 vs gp120 V3 loop)。5.gp120 V3环作用的突触体肿胀,Ca2+浓度升高,与对照组比,差异有统计学意义(P<0.05 vs control);尼莫地平与姜黄素可拮抗gp120 V3环对海马突触体的影响,减轻突触体肿胀,并降低突触体内Ca2+浓度(P<0.05 vs gp120V3 loop);姜黄素与尼莫地平单独作用对突触体显微结构及其Ca2+浓度无明显影响(P>0.05 vs control)。结论：1.姜黄素对大鼠海马神经元的药理作用具有浓度依赖性,低浓度(1μmol／L)具有保护作用,高浓度(>2μmol／L)则具有损伤作用；gp120 V3环对大鼠海马神经元的损伤具有时间依赖性,本实验1nmol／L gp120 V3环作用4h适于观察其对大鼠海马神经元突触的损伤作用,24h适于观察突触损伤后神经元凋亡的情况。2.姜黄素可抑制gp120 V3环引起的大鼠海马神经元L-型Ca2+通道过度激活,降低细胞内Ca2+浓度,改善gp120 V3环对突触生长的抑制,并改善gp120 V3环引起的大鼠海马神经元线粒体膜电位降低、核固缩,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,降低促凋亡基因Bax、caspase-3的表达,抑制大鼠海马神经元突触损伤后凋亡。3.姜黄素可拮抗gp120 V3环对大鼠海马脑片CA1区神经元LTP的抑制,维持LTP稳定,改善突触可塑性。4.姜黄素可降低gp120 V3环升高的大鼠海马突触体内Ca2+浓度,并减轻突触体肿胀。综上所述,姜黄素可保护gp120 V3环损伤的大鼠海马神经元突触,其机制可能通过抑制由gp120 V3环过度激活的L-型Ca2+通道,降低细胞内升高的Ca2+浓度,保护神经元突触形态和基本功能,并通过抑制L-型Ca2+通道降低细胞内Ca2+浓度,升高线粒体膜电位,抑制细胞内凋亡途径,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,降低促凋亡基因Bax、caspase-3的表达,抑制突触损伤后神经元的凋亡。