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目的:环状RNA（circluar RNA,circRNA）是一种在二十世纪七十年代发现的没有5’端帽子结构和3’端poly（A）尾巴并以共价键形成闭环结构的内源性RNA。近几年才刚刚兴起对环状RNA的研究,自从circRNA被发现以来,人们从最初对其结构和生物功能、作用机制的简单认识,进而将其与各种器官系统疾病联系起来进行了探索。现有研究表明circRNA与肿瘤、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、神经系统疾病、抑郁症等多种疾病相关,其中研究最热门的当数肿瘤性疾病。circRNA在皮肤相关疾病的研究主要集中在皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤和银屑病、皮肤创伤愈合这些方面。目前关于circRNA皮肤衰老方面研究相对缺如。皮肤是人体最大的器官,也是人体直接接触于外界环境的“门户”,皮肤的老化过程是一个复杂的过程,主要受两个因素的影响:一个是内源性因素（Intrinsic aging）,也被称为固有的皮肤老化（Chronologic aging）。另一种是受环境影响的皮肤老化过程,称为外源性皮肤老化,被称作外源性皮肤老化（Extrinsic aging）。眼睛作为五官之首是容貌的中心,眼部衰老在面部老化方面很突出。本项研究涉足circRNA与皮肤衰老这一领域,探索衰老相关机制,通过对组织、细胞相关功能实验的验证,我们可以观察到circRNA对皮肤衰老的作用和影响。方法:以眼睑皮肤作为老化的研究对象,采用第二代高通量测序测序技术（RNA-seq）检测老少两组眼睑皮肤样本中circRNA的差异表达,探索与皮肤衰老相关的异常表达circRNA,对差异circRNA的来源基因进行基因本体（GO）、生物学通路（Pathway）分析,从生物过程、分子功能、信号通路等方面全面探讨衰老形成机制。另外,对差异circRNA的靶向Micro RNA进行预测分析,构建circRNA-Micro RNA调控网络。根据高通量测序结果,从组织学水平筛选出10个差异表达明显的circRNA分子进行荧光定量PCR验证,最终遴选的2个circRNA分子做后续研究。通过组织块贴壁培养法获取皮肤成纤维细胞HSF,构建hsa＿circ＿0077605、hsa＿circ＿0137613过表达载体,观察过表达后对HSF细胞功能影响,包括β-gal染色实验、CCK8检测增殖情况和细胞流式周期实验。通过生物信息学分析预测hsa＿circ＿0077605的靶Micro RNA,应用双荧光素酶实验、FISH检测证实,hsa＿circ＿0077605结合的Micro RNA。结果:1.眼皮组织circRNA高通量测序共筛选出20552条circRNA,其中外显子来源的5432条,内含子来源的9318条,基因间区来源的5802条。老年组和少年组眼皮组织的差异circRNA总共14915个,以差异表达倍数FC≥1.5,P<0.05为筛选条件进行筛选。符合筛选条件的差异表达circRNA共有571个。在571个circRNA中,348个circRNA在衰老组中高表达,223个circ NRA在衰老组中低表达。GO分析和KEGG分析提示了差异表达的circRNA可能具有的生物功能和参与的通路。组织测序中筛选出10个差异circRNA,包括5个在衰老组上调的circRNA（hsa＿circ＿0077605、hsa＿circ＿0002957、hsa＿circ＿0137613、hsa＿circ＿0008089、hsa＿circ＿0000205）,和5个在衰老组下调的circRNA（hsa＿circ＿0112861、hsa＿circ＿0003803、hsa＿circ＿0032813、hsa＿circ＿0113488、hsa＿circ＿0026497）。通过RT-qPCR验证,发现大部分的结果与组织测序数据吻合,其中hsa＿circ＿0077605和hsa＿circ＿0137613在衰老皮肤组中显著上调,表达差异倍数明显,可作为后续的研究对象。2.通过组织块贴壁培养法获取HSF。hsa＿circ＿0077605环化接头处的序列与其他基因同源性很高,强行设计si RNA可能会导致si RNA的脱靶,因此无法设计特异性si RNA序列。hsa＿circ＿0137613设计出2条si RNA。在HSF使用RT-qPCR检测HSF细胞中的hsa＿circ＿0137613水平,hsa＿circ＿0137613本底表达非常低,做RNA敲降无意义,最终决定遴选的2个circRNA分子在后续研究方向均做过表达。3.遴选的2个circRNA分子做过表达载体构建及测序鉴定。以聚合酶链反应（PCR）分别扩增两个circRNA的全长序列,接入到p LC5-ci R质粒中,构建hsa＿circ＿0077605、hsa＿circ＿0137613过表达质粒。分hsa＿circ＿0077605/hsa＿circ＿0137613、NC（p LC5-ci R）和Control三组,用Lipofectamine2000转染试剂转染至293T细胞,qPCR检测过表达效率。与转染空载质粒的对照组相比,hsa＿circ＿0077605的过表达倍数为3380,hsa＿circ＿0137613组的过表达倍数为98748,qPCR产物测序显示环化序列正确。以上结果表明hsa＿circ＿0077605、hsa＿circ＿0137613能在真核细胞中成功过表达。在HSF细胞中过表达hsa＿circ＿0077605/hsa＿circ＿0137613后,对HSF细胞功能影响包括三方面实验:β-gal染色实验、CCK8检测增殖情况和细胞流式周期实验。hsa＿circ＿0077605/hsa＿circ＿0137613过表达的HSF细胞表现出典型的形态衰老。β-gal染色显示细胞形态变宽变平,细胞质透明,核颗粒增多,近衰老细胞核呈蓝色。体外培养HSF 3天,过表达组CCK8细胞增殖活性明显降低。流式检测仪进行检测细胞周期,显示过表达组HSF G1期明显增多,S/G2期减少,HSF细胞的DNA复制受到抑制。4.通过三种生物信息学软件miRanda、RNAhybrid和Target Scan预测剪接序列长度为151 bp的hsa＿circ＿0077605可能结合的miRNA,发现三种软件均预测到hsa-miR-612。通过双荧光素酶实验证实,hsa＿circ＿0077605能有效结合hsa-miR-612。为进一步验证hsa＿circ＿0077605与hsa-miR-612的在细胞中的亚定位进行FISH共定位实验,在共聚焦显微镜下观察hsa＿circ＿0077605主要定位于HSF细胞浆内,且hsa-miR-612也主要在HSF细胞浆中定位,通过两者的共定位可以观察到在细胞浆中存在hsa＿circ＿0077605与hsa-miR-612的共定位。上述实验结果提示hsa＿circ＿0077605与hsa-miR-612结合,hsa＿circ＿0077605/hsa-miR-612轴与皮肤衰老相关。结论:1.circRNA在皮肤衰老过程中出现差异表达,说明circRNA可能参与皮肤衰老的基因调控。2.hsa＿circ＿0077605和hsa＿circ＿0137613在HSF中的低表达提示后续进行过表达研究。3.过表达hsa＿circ＿0077605、hsa＿circ＿0137613可诱导HSF老化。4.FISH检测和双荧光素酶实验证实hsa＿circ＿0077605与hsa-miR-612存在相互作用。hsa＿circ＿0077605/hsa-miR-612轴与皮肤衰老相关。