狂犬病毒是一种致死性的神经嗜性病原微生物,由于其很高的致死率以及目前缺乏很好的防治方法,对人类和相关宿主动物的健康造成了巨大的威胁,也因此成为了病原学中一个很重要的研究对象。另一方面因其具有对神经元的特殊嗜性以及在神经元内生存和复制的能力,狂犬病毒被开发成为了一种用来神经环路示踪和标记的有力工具,相对于传统的神经环路示踪工具有着天然优势,在神经科学的研究中具有巨大的应用价值和开发潜力。单细胞测序技术作为近几年发展起来的新型技术,凭借其独有的优势为现代生物学的发展起到了巨大的推动作用,通过对单个细胞组学相关信息的分析实现在细胞和分子层析探索相关生物学过程以及复杂组织的结构和功能的解析,在发育、癌症以及神经科学等研究领域具有不可替代的应用潜力。大脑,作为目前动物体中结构和功能最复杂的器官,已成为现在生命科学和医学研究领域最热门也最有挑战性的领域,对其深入的研究和探索对理解大脑运行机制以及对相关脑疾病的防治提供理论意义和指导作用。而对于大脑奥秘的揭示,最重要的一步是对其中数量庞大而又错综复杂神经环路结构和功能的解析。于是,基于以上相关技术和科学背景,本课题主要的目的是利用狂犬病毒对特异神经环路进行示踪和标记,描绘对应神经环路的结构基础,同时结合单细胞测序技术对标记的特异神经环路上的神经元进行单细胞水平上的转录组分析,分析对应神经环路的功能基础。从而实现对特定神经环路结构和功能的解析,为进一步深入探索神经环路的调节机制以及在受到外界病原入侵时如何变化提供科学基础和研究思路。本课题的研究内容主要分为以下几个方面:1.片段化酶Tn5的纯化和应用Tn5是来源于大肠杆菌中一种转座酶,由于其在体外可以转座以及对DNA片段进行切割和连接接头的能力被开发为二代测序文库构建时用于片段化和接头化的工具酶,并在单细胞测序文库构建中具有很广泛的应用价值。在该课题中,我们首先对其进行了表达、纯化和组装。其次对其进行了活性检测,验证了Tn5具有DNA片段化和加接头的能力。最后我们经过不断优化反应条件将其成功应用到单细胞转录组测序Smart-seq2建库方法中,节省建库成本的同时又可以进行特殊功能应用的扩展。2.Smart-seq2技术在培养细胞和特异神经环路神经元上的应用Smart-seq2技术是目前最常用的单细胞RNA-seq技术,我们首先通过不断地尝试和摸索将其应用到培养的细胞上,做到了个位数细胞起始量的转录组扩增。然后结合狂犬病毒对特异神经环路神经元的标记和分离技术,将其应用到特异神经环路神经元上,完成了对神经环路单个神经元转录组的建库测序和数据分析,从而实现对感兴趣的特定神经环路结构的解析和功能的探索。3.PVN-LHA神经环路的标记和初步探索PVN是下丘脑中具有调节机体相关自主性的生理功能作用的神经核团,PVN-LHA神经环路对于机体饮食的调节起着直接的影响,对其深入的研究可以理解大脑对饮食行为的调节机制以及在受到病原入侵时的响应。本课题中,我们首先利用GFP重组的狂犬病毒对PVN-LHA环路进行了标记,然后对在PVN处标记的神经元进行了单细胞转录组测序实验。我们分析了这些神经元的基因表达谱,并对神经元类型和功能相关的基因表达情况做了免疫组化方面的验证,为进一步深入研究提供了数据基础。总体而言,本课题结合狂犬病毒对特异神经环路的示踪标记技术和单细胞RNA-seq技术,实现了在特定神经环路上神经元单细胞转录组分析技术的建立,并将其应用到PVN-LHA神经环路,初步鉴定了该环路PVN处神经元的类型和功能,为进一步研究此环路提供了一定的技术,而且这两种技术的结合为神经科学相关问题的研究提供了一定的技术基础和研究思路。