土壤盐渍化是影响作物生长及产量的主要非生物胁迫,NaCl是引起盐胁迫的首要因子,植物在盐胁迫中保持高K~+/Na~+比对植物的耐盐性有密切关系。植物HKT家族在植物耐盐方面的作用受到广泛关注。目前关于拟南芥、小麦、水稻等非盐生植物HKT1的研究很多,主要认为植物中HKT1蛋白在植物体内Na~+运输和Na~+稳态维持中起到重要作用。近年来,盐生植物耐盐机制的研究也受到越来越多的重视。对于盐芥、盐地碱蓬等盐生植物HKT1的研究也有了一定进展,研究表明,盐生植物HKT1蛋白更倾向于K+的吸收,这与非盐生植物HKT1蛋白明显不同。研究盐生植物HKT1对于进一步揭示植物耐盐机制有重要作用。本实验室采用真盐生植物盐地碱蓬为材料已经克隆了SsHKT1,证明SsHKT1运K~+而不运Na~+,SsHKT1表达受低K+和NaCl处理诱导,而且SsHKT1表达在高盐处理下保持高水平。为了探讨SsHKT1调控的分子机理及SsHKT1在植物耐盐方面的作用,本实验克隆了SsHKT1启动子,对启动子特性及活性进行了初步探索,另外还对盐地碱蓬SsHKT1在水稻中的功能进行初步研究,主要研究结果如下:1. SsHKT1基因启动子序列的扩增根据已发表的SsHKT1 cDNA序列,设计了一系列嵌套的特异性引物,以盐地碱蓬基因组DNA为模板,经三次TAIL-PCR后克隆得到启动子序列1044 bp,经BLAST比对后确定序列为盐地碱蓬SsHKT1启动子序列。2. SsHKT1基因启动子的序列元件分析用PLACE和PlantCARE对启动子序列进行分析,结果表明启动子序列中除含有TATA-box、CAAT-box等启动子典型顺式调控元件外,还含有一些重要的顺式调控元件:如NaCl诱导元件GT-1、防御和逆境响应元件TC-rich repeats、光诱导相关元件GATA-box和G-box、分裂组织表达相关元件CAT-box、胚乳特异相关元件Skn-1-motif等特异性表达元件。3. SsHKT1基因启动子的活性及表达分析用BamHⅠ和PstⅠ双酶切SsHKT1启动子,导入含有GUS表达基因的PCAMBIA 1391载体中,取代载体中的35 S启动子,构建了SsHKT1启动子-GUS载体。将载体转入农杆菌EHA105中,选取阳性克隆转化烟草叶片,对叶片进行GUS组织化学检测。结果表明,盐地碱蓬SsHKT1启动子能够驱动GUS基因在烟草叶片中表达,证明SsHKT1启动子具有启动子活性。用含有SsHKT1启动子-GUS载体的农杆菌侵染拟南芥花序,用50 mg/L的潮霉素对拟南芥种子进行筛选。对筛选出的抗性植株进行GUS染色分析,结果显示GUS基因主要在拟南芥的维管组织中表达。4. SsHKT1基因转化水稻分析将成熟的水稻种子置于NBD2培养基,诱导出的愈伤于NBD0.5培养基中继代培养。将PROKⅡ- SsHKT1质粒转化农杆菌EHA105,取阳性克隆侵染水稻愈伤组织。用50 mg/L的G418试剂对愈伤进行筛选,获得抗性愈伤。用RE培养基诱导抗性愈伤分化,分化出的幼苗经MS培养基壮苗后移入营养土中培养,获得了T0代转基因水稻植株,为研究SsHKT1在植物耐盐方面的作用奠定了基础。