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背景RNA结合基序蛋白3(RBM3)是一种冷休克蛋白,主要定位于细胞核中,具有许多重要的生物学功能,如神经保护。但其神经保护作用的分子发生机制并不清楚。研究表明其他多个具有RNA结合基序(RRM)或富含精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(RGG)结构域的RNA结合蛋白参与亚细胞定位、基因转录、mRNA翻译和细胞凋亡等生物过程的调节。同时RNA结合蛋白的蛋白质翻译后修饰(post-translational modification,PTM),如磷酸化和甲基化,对其生物学功能具有重要的调节作用。RBM3存在两个RRM和两个RGG基序以及多个潜在的PTM位点,然其生物学意义尚不明确。我们对RBM3不同结构域及其潜在PTM位点进行了分子突变,来探究它们对RBM3的亚细胞定位及神经保护功能的影响。目的1.探究RBM3不同的分子突变对其亚细胞定位的影响;2.研究RBM3分子突变对其神经保护作用的影响;方法1.构建RBM3不同结构域缺失及潜在PTM位点突变的重组质粒以pXJ40-myc作为表达载体,分别构建RBM3 RRM结构域(N端)或RGG结构域(C端)缺失的突变质粒(pXJ40-myc-RGG、pXJ40-myc-RRM),以及RBM3精氨酸甲基化位点突变的表达质粒(pXJ40-myc-RGG 1 mut、pXJ40-myc-RGG2 mut),所有的氨基酸替代均是丙氨酸。2.分析RBM3不同的分子突变对其亚细胞定位的影响将人神经瘤母细胞(SH-SY5Y)放置于37~o C恒温细胞培养箱中培养24 h,分别将RBM3各结构域和不同PTM位点突变的真核表达质粒瞬时转染入细胞中,48 h后提取核质分离蛋白质,运用Western blotting,细胞免疫荧光等方法检测RBM3在细胞中的定位。空载质粒pXJ40-myc和RBM3野生型质粒pXJ40-myc-RBM3作为对照组。3.评价RBM3分子突变对其神经保护功能的影响将RBM3各种分子突变体分别转染至SH-SY5Y细胞中48 h后,用过量的全反式视黄酸(RA)诱导细胞凋亡。运用Western blotting的方法检测细胞凋亡标志物cleaved PARP的蛋白质水平,以此评价各种RBM3分子突变对其神经保护作用的影响。结果1.成功构建RBM3不同结构域缺失及潜在PTM位点突变的重组质粒,共8个。2.无论RBM3的N端RRM结构域还是C端的RGG结构域缺失后,均导致RBM3的细胞定位发生变化,使主要定位于核内的RBM3向细胞质内转移。除此之外,RBM3上RGG结构域内潜在的两对精氨酸位点AA87/90和AA99/105突变后,亦促进了RBM3蛋白质由细胞核向细胞质中转移。与之相比,RBM3上Ser102、Tyr129、Ser147和Tyr155等潜在磷酸化位点的突变对RBM3的亚细胞定位没有显著影响。3.利用RA相关的细胞凋亡模型,发现无论RBM3的N端结构域缺失还是C端结构域缺失,均导致RBM3的神经保护能力下降。此外,RBM3上的Arg99/105突变后,不但使RBM3的神经保护效果完全丧失,且增加了RA的细胞毒性。意外的是,RBM3上的Arg87/90突变后,其神经保护效果超过野生型RBM3的保护效果,提示该突变对RBM3的神经保护作用有增强效果。结论1.RBM3的N端RRM结构域和C端的RGG结构域的协同作用促进RBM3蛋白质的核定位,提示二者可能均含RBM3蛋白质的核定位信号。2.RBM3上RGG结构域内的精氨酸AA87/90或AA99/105协同作用维持RBM3的核内定位。3.RBM3的N端结构域和C端结构域和精氨酸对Arg99/105均参与RBM3的神经保护功能。但Arg87/90对RBM3的神经保护功能存在抑制作用。Arg87/90突变引发RBM3神经保护作用的增强这一意外发现,为深入揭示RBM3神经保护功能的分子作用机制提供了重要的研究线索。