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目的:肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是机体对肺组织损伤的过度修复和重塑的病理结果,而肌成纤维细胞(myofibroblasts, MFbs)正是导致胶原大量分泌、组织过度修复的主要效应靶细胞,其在间质中数量增加并持续活化被认为是病程向纤维化进展的重要标志。MFbs主要由间质中的成纤维细胞(fibroblasts, Fbs)转化而来,后者在缺氧、促纤维化细胞因子等因素的诱导下表达MFbs的特征性蛋白分子——α-SMA,从而转化为MFbs,发挥更强的致纤维化作用,因此,大量活化的Fbs转化为致纤维化能力更强的MFbs的病理过程是PF进程的关键环节。回顾文献发现,肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)作为血管壁基本的结构和功能单位,是血管屏障的重要组成部分,它不仅在生理状态下调节血管内外的物质交换、稳定机体的内环境;还在病理状态下超早期的发生应激反应,促进组织修复。然而,它在消除致病因子对机体损伤的同时也可能由于某种原因而过度地发挥了介导免疫、炎症反应,加重组织缺氧,分泌过量细胞因子等生物学作用,从而促进了组织的纤维性修复。文献显示,上述病态的PMVECs功能可能在Fbs向MFbs转化的病理过程发挥着重要作用,本实验将采用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法检测PMVECs中相关细胞因子的合成、分泌水平,并使用millicell细胞共培养体系,结合抗体中和试验,研究体外共培养条件下,BLM大鼠PMVECs对Fbs的生物学作用及其机制,进一步揭示PMVECs及其功能表型变化在PF早期病程中的作用。方法:SD大鼠,体重100±20 g,雄性,以博莱霉素(Bleomycin,BLM)-A5溶液气管内灌注的方法诱导大鼠PF模型,并在相同条件下向正常大鼠气管内灌注等体积生理盐水作为对照。分别于给药后第3,7,14,21和28天处死大鼠,取外周肺组织留作原代培养PMVECs和Fbs,其余肺组织用10 g/L多聚甲醛固定后石蜡包埋、切片、VG染色。在各时间点原代培养PMVECs和Fbs后,利用ELISA、Western Blot、RT-PCR等方法检测各组大鼠PMVECs合成、分泌细胞因子TGF-β1及CTGF的水平;并将各组大鼠PMVECs分别与预先培养、传代的对照组大鼠Fbs共培养,采用细胞生长曲线测定、PCNA免疫组化染色、流式细胞染色、Western Blot等方法,检测共培养后的Fbs的增殖、转化及胶原合成能力,并以单培养的各组大鼠Fbs的相应功能作为阳性对照,进行比较分析;结合细胞因子抗体中和试验检测PMVECs细胞因子分泌功能的变化与其促Fbs增殖、转化功能的相关关系。结果:1、BLM大鼠PMVECs的对数生长期较对照组大鼠PMVECs提前。2、免疫荧光染色及Western Blot检测证实BLM诱导大鼠PF过程中PMVECs上调TGF-β1和CTGF蛋白的表达,且高峰出现在BLM气管内灌注后7天组PMVECs。经RT-PCR鉴定,BLM气管内灌注后7天组PMVECs中TGF-β1和CTGF的转录显著升高。ELISA实验证实,各组PMVECs培养上清中TGF-β1和CTGF的分泌水平与Western Blot检测的细胞中相应蛋白的表达水平基本一致。3、细胞免疫荧光染色及Western Blot检测证实BLM大鼠PMVECs中出现α-SMA蛋白的表达,其高峰亦位于BLM气管内灌注后7天组。4、生长曲线及PCNA染色显示与BLM气管内灌注后7、14、21、28天组PMVECs共培养的Fbs的对数生长期提前,核增殖能力明显高于对照组。流式细胞染色及Western Blot结果显示与BLM气管内灌注后7天组PMVECs共培养的Fbs群中,MFbs数量显著增加,α-SMA蛋白的表达亦明显上调;与BLM气管内灌注后7、14天组PMVECs共培养的Fbs中ColⅠA1的表达显著上调。5、抗体中和试验显示,单独使用TGF-β1抗体使共培养上清中TGF-β1的浓度下降约53.15±8.91%,可使共培养的Fbs数量减少约23.39±2.12%,Fbs群中MFbs百分比下降约4.68±0.86%(降幅约22.48%);单独使用CTGF抗体使共培养上清中CTGF的浓度下降约54.65±10.24%,可使共培养的Fbs数量减少约45.16±5.79%,Fbs群中MFbs百分比下降约8.06±1.31%(降幅约38.71%);而联合使用TGF-β1和CTGF抗体使共培养上清中TGF-β1和CTGF浓度同比下降约50%,可使共培养的Fbs数量减少约73.39±11.89%,Fbs群中MFbs百分比下降约10.15±1.37%(降幅约48.75%)。结论:1、BLM诱导的大鼠PF过程中,PMVECs合成、分泌促纤维化细胞因子TGF-β1及CTGF的功能上调,尤其在病程早期,PMVECs合成、分泌细胞因子功能旺盛,细胞以分泌功能表型为主。2、在体外共培养条件下,BLM大鼠PMVECs可促进正常鼠Fbs的增殖、转化及胶原合成,并以BLM气管内灌注后7天大鼠PMVECs的促Fbs增殖作用最强。3、以TGF-β1及CTGF高表达为代表的PMVECs表型异常是促进Fbs活化、增殖并转化为MFbs,进而导致细胞外基质过度分泌的重要原因;也可能是生理状态下早期激活间质中静止的Fbs,并促进其发挥致纤维化作用的关键因素。