由于烧烫伤、糖尿病、长期卧床压迫等原因引起的大面积的全层皮肤损伤,目前仍然是临床治疗的一大难题。传统的自体皮或异体皮移植,虽然有一定的治疗效果,但却存在移植体来源受限和免疫排斥问题。随着组织工程学的发展,关于人工皮肤的研究与应用正越来越受到关注,为全层皮肤损伤的修复提供了新方向。众所周知,支架材料、种子细胞和皮肤再生相关生长因子是组织工程皮肤的三大要素,其中的生物材料和种子细胞共同组成了组织工程皮肤的主体构架。以生物可降解合成高分子材料为基础材料制备的人工皮肤,是近年来新兴的一种人工皮肤,其中所使用的生物可降解合成高分子材料,不仅来源非常广泛,还具有良好的生物相容性与可降解性,是一种理想的组织工程皮肤材料。种子细胞的选择对于组织工程皮肤的构建尤为重要,所选细胞应具有较好的增殖能力和成皮分化能力,且容易大量获得,而干细胞恰恰符合这一系列标准。已有的大量研究中,研究者将多种干细胞作为种子细胞,应用于组织工程皮肤的构建当中,均取得了良好的效果,为干细胞在皮肤组织工程中的应用开辟了道路。与其他两大要素不同,生长因子在组织工程中的作用主要是功能性的。生长因子的引入可以大大地增强支架材料的生物活性,从而让种植于材料表面的种子细胞更好地生长。生长因子属于正常细胞分泌的物质,因而具有低毒性,低免疫原性,高效性等优点。但是,由于生长因子存在半衰期短、易随血液扩散流失等缺点,导致其无法长期稳定地作用于患处,阻碍了其在临床应用方面的发展。本研究的目标是制备一种性能优良的干细胞衍生的组织工程皮肤,应用于全层皮肤损伤修复。首先,我们通过基因工程、发酵工程和后期酶促反应,制备出了具有材料粘附能力的表皮细胞生长因子(DOPA-EGF),并将其粘附于聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA]静电纺丝膜上;之后,我们将人源脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hUCMSC)种植于修饰后的静电纺丝膜上,构建成了一种干细胞衍生的组织工程皮肤;最后,我们利用该组织工程皮肤对大鼠背部全层皮肤缺损模型进行了修复,以评价这种组织工程皮肤的修复效果。具体研究内容如下:1.利用基因工程技术将含有酪氨酸重复结构单元(Tyrosine-Lysine-Tyrosine-Lysine-Tyrosine,YKYKY)的短肽基因序列整合到EGF基因序列末端,并装载于pET21b质粒载体中。再将该重组质粒载体转化至BL21(DE3)大肠杆菌中,构建出用于表达DOPA-EGF前体蛋白(YKYKY-EGF)的大肠杆菌原核表达载体。经过一系列的表达与纯化过程,我们成功获得了YKYKY-EGF。之后,我们利用酪氨酸酶的酶促羟化反应,将YKYKY-EGF进一步转化成DOPA-EGF。圆二色谱(circular dichroism,CD)检测和生物活性检测结果显示,无论是YKYKY-EGF,还是DOPA-EGF,其二级空间结构和生物活性均与天然的EGF相一致;2.利用静电纺丝技术,我们成功制备了PLGA静电纺丝纤维膜。扫描电子显微镜观察结果显示,所制得的PLGA静电纺丝纤维膜是由大量的微米级纤维叠加而成的疏松多孔结构,单根纤维的直径约为5~10μm,纤维之间孔隙直径约为20~50μm。进一步地,我们利用酶联免疫吸附试验(ELISA),傅里叶红外吸收光谱(FITR)和X射线光电子能谱分析(XPS)定性地测试了DOPA-EGF在PLGA静电纺丝膜上的粘附能力。结果显示,DOPA-EGF对于PLGA静电纺丝膜的粘附能力要显著高于EGF和YKYKY-EGF。之后,我们又对修饰后的PLGA静电纺丝膜的亲水性进行了检测,发现,DOPA-EGF的修饰可以大大提高PLGA静电纺丝膜的亲水性;3.通过将hUCMSC接种于修饰后的PLGA静电纺丝膜上,我们成功制备了一种干细胞衍生的组织工程皮肤。细胞粘附和增殖检测结果显示,DOPA-EGF修饰的PLGA静电纺丝膜更有利于hUCMSC在其表面的粘附与增殖。进一步地,免疫荧光染色和实时定量PCR结果显示,在EGF的诱导下,hUCMSC逐渐分化成皮肤干细胞(skin stem cells,SSCs),并分泌大量的有利于皮肤修复的细胞外基质成分(COLI)和有利于组织血管化的血管内皮细胞生长因子(VEGF);4.我们利用大鼠背部全层皮肤缺损模型,对所制备的组织工程皮肤的修复效果进行了评价。结果显示,DOPA-EGF组无论从创面闭合程度,创面平整程度,新旧组织融合度还是血管化程度上,都要明显优于其他各实验组和空白对照组。综上所述,我们成功制备了一种基于DOPA-EGF改性PLGA电纺丝膜的干细胞衍生组织工程皮肤。该组织工程皮肤可以有效促进大鼠背部全层皮肤缺损的修复,具有较好的临床应用前景。