2013年3月,中国出现首例人感染新型H7N9禽流感病毒的病例,至今引起了五波流行,共导致1567人感染,死亡率接近40%。在第五波流行中爆发的H7N9高致病性禽流感病毒,对中国家禽贸易和活禽市场构成严重威胁;同时感染人数也急剧增加,感染范围进一步扩大,引起了国内外广泛关注,这些病毒是最有可能导致下一次流感大流行的亚型。因此,针对H7N9禽流感开发一种安全有效的疫苗非常重要。与传统疫苗相比,亚单位疫苗具有更高的安全性,能减少疫苗生产时间。但是,亚单位疫苗的免疫原性较弱,需要添加佐剂来增强其免疫原性。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是细胞表面能够识别病原相关分子模式的一种受体家族,在天然免疫系统中发挥重要作用。鞭毛蛋白是一种TLR5配体,其佐剂活性不断在多种病原上得到验证,但其作为H7N9禽流感亚单位疫苗佐剂,能否诱导抗原特异性细胞免疫应答尚不完全清楚,而细胞免疫对于预防流感病毒这类胞内感染的病原亦十分重要。由于哺乳动物和家禽免疫系统的差异,鞭毛蛋白在家禽流感疫苗中的作用和机制,例如将鞭毛蛋白与抗原融合后,如何激活家禽天然免疫系统,诱导何种免疫应答类型偏向(Th1或Th2),在家禽中能否诱导黏膜免疫应答,是否能促进抗原诱导的免疫保护效应等尚不完全清楚。鞭毛蛋白是一种强效的佐剂候选,但是它自身的抗原性很强,可能影响其佐剂活性;而且高剂量的鞭毛蛋白可诱导潜在的炎性损伤,引发一些副反应,可能限制其临床应用。因此,减弱鞭毛蛋白的副反应,并维持其佐剂活性,开发具有调节免疫功能的改良型鞭毛蛋白佐剂,应作为人用疫苗佐剂重点研究的方向,这也是一项重要的挑战。鞭毛蛋白发挥佐剂作用的分子机制,一是通过与细胞表面TLR5受体结合,激活MyD88依赖的通路,促进多种细胞因子表达;二是与细胞质中NLRC4受体结合,激活炎性小体,促进炎性因子的表达和分泌;从而激活免疫细胞和非免疫细胞。巨噬细胞是天然免疫系统的吞噬细胞,位于各种组织中,是生物体抗感染的第一道防线。转录组测序(RNA-Seq)是通过高通量测序平台,快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下几乎所有的转录本和基因序列,可从整体水平上反映出细胞中基因的表达情况及其调控规律,因此可作为研究鞭毛蛋白与巨噬细胞相互作用的重要手段,以期补充和完善其激活天然免疫应答的分子机制。1.小鼠模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究以H7N9禽流感亚单位疫苗血凝素(Hemagghutinin,HA)球状部HA1-2抗原为对照,评价其与沙门菌鞭毛蛋白(FliC)的融合蛋白HA1-2-FliC在体内外的佐剂活性。体外细胞实验结果显示,与HA1-2组相比,HA1-2-FliC刺激C3H/HeJ小鼠的BMDCs和脾脏淋巴细胞后,能显著上调细胞因子和趋化因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL2和CXCL10)的表达水平,表明鞭毛蛋白能促进小鼠免疫细胞的活化。通过腹腔免疫C3H/HeJ小鼠,研究鞭毛蛋白对H7N9禽流感HA1-2亚单位疫苗免疫原性的影响。结果显示,二免后12 d,相比于单独HA1-2免疫组,HA1-2-FliC可显著提高HA1-2特异性IgG和血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)抗体水平。同时,HA1-2-FliC诱导的IgG亚型(IgG1和IgG2a)水平均显著提高;ELISpot结果显示脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ和IL-4的细胞数量相当,均显著高于HA1-2组,这些结果表明HA1-2-FliC可诱导Th1/Th2混合型免疫应答。此外,HA1-2-FliC免疫组小鼠脾脏中T细胞表面CD69分子表达量显著增加,细胞增殖水平显著提高,进一步表明HA1-2-FliC能有效地诱导抗原特异性细胞免疫应答。综上所述,本研究结果表明候选疫苗HA1-2-FliC能够有效促进小鼠免疫细胞的活化,诱导高效的HA1-2特异性体液和细胞免疫应答,为研制H7N9禽流感病毒重组亚单位疫苗提供了重要的基础。2.家禽模型中鞭毛蛋白在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究在体外和离体条件下,检测了鞭毛蛋白作用不同类型禽免疫细胞后诱导的细胞因子和趋化因子的表达谱。结果显示,鞭毛蛋白刺激禽巨噬细胞系HD11后,显著提高了 CXCL炎性趋化因子(CXCLi1和CXCLi2)和CCL趋化因子(MIP-1β和MCP-3)的表达水平。此外,融合蛋白HA1-2-FliC体外刺激SPF鸡脾脏淋巴细胞和外周血单核细胞(PBMCs)后,显著上调细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-18和IFN-γ)和趋化因子(CXCLi1、CXCLi2和MIP-1β)的表达,表明鞭毛蛋白能在体外激活禽细胞的免疫应答。本研究还评估了 HA1-2-FliC免疫SPF鸡后诱导的抗原特异性体液和细胞免疫应答,结果显示,肌肉注射HA1-2-FliC候选疫苗,可显著提高血清中HA1-2特异性IgG水平。此外,CD4+和CD8+T细胞显著增加,PBMCs增殖能力的显著提高均反映了HA1-2-FliC可诱导鸡体产生强效的细胞免疫应答。接种HA1-2-FliC后,鸡PBMCs中IFN-γ和IL-4的表达量均显著提高,表明鞭毛蛋白FliC在鸡模型中也可促进了Th1/Th2混合型免疫应答。通过鼻腔内免疫SPF鸡,评价鞭毛蛋白作为H7N9禽流感亚单位疫苗的黏膜佐剂,在鸡模型中诱导的免疫保护效应。结果显示,免疫HA1-2-FliC候选疫苗后,显著提高了血清中HA1-2特异性IgG,鼻腔和支气管肺泡灌洗液中HA1-2特异性IgA水平。此外,攻毒结果显示,与HA1-2免疫组相比,添加FliC佐剂能显著降低鸡喉头和泄殖腔中的病毒载量,提高机体清除病毒的能力。综上所述,鞭毛蛋白在体内和体外均能活化禽免疫细胞,促进多种细胞因子和趋化因子的表达;通过肌注和滴鼻免疫SPF鸡,HA1-2-FliC均能显著增强流感亚单位疫苗HA1-2的免疫原性和免疫保护效应,这些发现为在家禽中开发H7N9禽流感HA1-2亚单位疫苗提供了依据。3.改良型鞭毛蛋白FliCΔD2D3在H7N9禽流感亚单位疫苗中的佐剂效应本研究构建了一种改良的鞭毛蛋白佐剂FliCΔD2D3(缺失与鞭毛蛋白抗原性相关的高变区D2和D3),将H7N9禽流感病毒HA1-2抗原融合到FliCΔD2D3的N端,得到改良型H7N9禽流感亚单位疫苗候选HA1-2-FliCΔD2D3。原核系统表达的HA1-2-FliCΔD2D3免疫反应性良好,保留了 TLR5配体活性,可以在体外和离体条件下激活小鼠巨噬细胞、脾脏和外周血单核淋巴细胞,促进各种细胞因子和趋化因子的表达。将 HA1-2、HA1-2-FliC 和 HA1-2-FliCΔD2D3 蛋白腹腔免疫 BALB/c 小鼠,在免疫早期,HA1-2-FliCΔD2D3 诱导产生炎性细胞因子(IL-6、IL-12p40、TNF-α 和 IL-23p19)的水平均显著低于HA1-2-FliC组。二免后12 d,与HA1-2-FliC组相比,HA1-2-FliCΔD2D3组显著降低了血清中鞭毛蛋白自身特异性抗体水平,但并不影响HA1-2特异性抗体和细胞免疫应答水平。IFN-γ/IL-4表达水平表明FliCΔD2D3仍可促进Th1/Th2混合型免疫应答。SPF鸡免疫和攻毒保护实验结果显示,添加FliCΔD2D3佐剂的疫苗比单独HA1-2疫苗诱导更高水平的抗体应答,与FliC佐剂组一致,均能显著减少鸡喉头和泄殖腔中病毒载量。综上所述,本研究构建的改良型H7N9禽流感候选亚单位疫苗HA1-2-FliCΔD2D3显著降低FliC的免疫原性,减弱由其引起的全身性炎性反应,但不影响其佐剂活性。改良后的鞭毛蛋白佐剂FliCΔD2D3为开发更安全有效的人用流感亚单位疫苗提供了基础。4.鞭毛蛋白诱导细胞表达IFN-β的初步探究本研究利用转录组测序(RNA-seq)技术对鞭毛蛋白刺激的RAW264.7细胞基因表达水平进行分析。测序结果显示,共筛选出2204个显著差异表达基因,其中上调表达基因1114个,下调表达基因1090个。KEGG Pathway分析中,富集到免疫相关途径的显著差异表达基因数量最多。GO功能分析中,生物过程分布的显著差异基因主要集中在代谢、正向调控、免疫、防御和应答等过程。其中,值得注意的是,鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞后,涉及多条通路的IFN-β基因显著上调表达。通过qRT-PCR和ELISA方法验证了 RNA-seq结果,发现鞭毛蛋白不仅可以刺激RAW264.7细胞,也可以刺激小鼠BMMs和BMDCs细胞上调表达IFN-β。为了进一步排除鞭毛蛋白FliC提取过程中其它因素对实验的影响,本研究在刺激RAW264.7细胞时,设置同步提取的FliC-FljB-和FliC+Trypsin组作为对照,结果显示,FliC-FljB-和Trypsin+FliC组均不能促进IFN-β上调表达,进一步证明了 FliC本身具有诱导细胞上调表达IFN-β的能力。根据鞭毛蛋白的结构特征,本研究构建并表达His标签融合蛋白FliC、N-FliC、C-FliC和FliCΔD2D3。结果显示,原核表达的全长FliC及其不同结构域片段均具有良好的免疫反应性,其中FliC和FliCΔD2D3具有良好的TLR5配体活性,与预期一致。用不同结构域鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞后,FliC、C-FliC和FliCΔD2D3蛋白均能显著提高IL-1β和IFN-β上调表达;而N-FliC与阴性对照一致,表明鞭毛蛋白刺激RAW264.7细胞上调表达IFN-β的关键结构域是与IL-1β一致,均是C-FliC。这些发现为鞭毛蛋白佐剂机制的进一步研究提供了新的科学线索。