论文部分内容阅读
帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的第二大神经退行性疾病,其主要病理学改变是中脑黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNpc）多巴胺（dopamine,DA）能神经元的选择性缺失,残存的神经元内alpha-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）异常聚集形成路易小体（Lewy body,LB）,进而引起静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势反射异常等临床表现。目前,PD的确切发病原因尚不明确,遗传、环境、老龄化、炎症、氧化应激以及铁的异常聚集均参与了PD的发生。凋亡、自噬以及坏死等多种细胞死亡方式参与了PD黑质区DA能神经元的退行性病变过程。铁死亡是一种铁依赖的氧化损伤引起的新型细胞死亡方式,在形态学、生物化学和遗传学等方面与凋亡,坏死和自噬有较大差别。作为铁依赖性的细胞死亡方式,铁在铁死亡中起到重要作用。PD病人的神经影像检查以及尸检病理报告证实在黑质内有大量铁的沉积,残存的DA能神经元内铁含量增高。因此,PD病人早期铁选择性聚集在黑质,提示铁可作为反映PD病程进展的一种生物标记物和影像学指标。近期的研究发现铁死亡参与了PD的发生过程,但铁死亡在PD黑质DA能神经元退行性病变中的作用未知,和其他死亡方式的关系也尚不明确。该问题的阐明,将为了解PD黑质铁聚集的机制和发病机制提供新的思路。本实验选择具有DA能神经元特点的MES23.5细胞,通过建立不同浓度（10mg/L,50 mg/L,100 mg/L）枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate,FAC）损伤MES23.5细胞的高铁细胞模型,同时选用H2O2（200μmol/L）和铁死亡诱导剂Erastin（10μmol/L）作为氧化应激引起的细胞死亡和铁死亡的对照。应用透射电子显微镜、流式细胞术、Western blots等技术方法观察不同浓度FAC损伤后的细胞形态、细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase,GPX4）蛋白的表达变化和脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量的变化,观察FAC损伤中的铁死亡现象。检测Bcl2和Bax蛋白的表达和caspase-3活性的变化,观察FAC损伤中的凋亡现象。应用铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）、铁螯合剂去铁胺（deferoxamine mesylate salt,DFO）和凋亡抑制剂ABT-263预处理FAC损伤的MES23.5细胞,检测GPX4、Bcl2和Bax等蛋白的变化;进一步应用Western blots技术检测不同浓度FAC诱导细胞死亡时MAPK和p53信号通路的变化,初步探究FAC诱导细胞铁死亡发生的可能分子机制;同时在不同月龄携带人A53T突变型alpha-突触核蛋白(α-Syn A53T+/+)的转基因PD小鼠上,应用Weatern blots技术检测小鼠黑质区GPX4、Bcl2和Bax蛋白变化,分析铁死亡和凋亡在FAC诱导的高铁细胞中的关系。研究结果如下:1、不同浓度（10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L）FAC处理MES23.5细胞24 hrs后,10 mg/L和50 mg/L FAC组细胞核无明显变化,100 mg/L FAC组细胞的细胞核出现染色质固缩和边缘化,线粒体膜出现自溶现象。铁死亡诱导剂Erastin处理后,细胞核无明显变化,而H2O2组可观察到细胞核固缩变形。细胞线粒体长轴的测量数据显示,10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L FAC组细胞的线粒体长度分别减少了5%、11%和23%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.01）。Erastin处理组细胞的线粒体长度减少了10%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。H2O2处理组细胞线粒体长度增加了22.6%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。2、不同的处理因素作用MES23.5细胞24 hrs后,10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L FAC组细胞内ROS含量分别升高了83.5%、126.6%和128.2%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05,P<0.001）。Erastin和H2O2组,细胞内ROS含量分别升高了46.3%和48.8%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.01）。3、不同处理因素作用MES23.5细胞24 hrs后,10 mg/L FAC组细胞内GPX4蛋白表达无显著变化,与对照组相比,差别无统计学意义（P>0.05）。50 mg/L和100mg/L FAC处理组细胞内GPX4蛋白表达分别降低了27%和45.6%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）。Erastin处理组细胞内的GPX4蛋白水平下调了43.5%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。H2O2处理组细胞内GPX4蛋白水平无明显变化,与对照组相比,差别不具有统计学意义（P>0.05）。10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L FAC处理组细胞内的MDA含量分别升高了66.9%、102.3%和166.8%,差别具有统计学意义（P<0.001）。Erastin处理后细胞内的MDA含量上调了144.6%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。H2O2处理后细胞内的MDA含量上调了70.4%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。4、不同浓度的FAC处理MES23.5细胞24 hrs后,结果显示,与对照组相比,10 mg/LFAC处理对细胞内Bcl2/Bax的蛋白比值无显著影响,与对照组相比,差别不具有统计学意义（P>0.05）。50 mg/L和100 mg/L FAC处理组细胞内的Bcl2/Bax的蛋白比值分别下调了11%和74%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05,P<0.001）。而Erastin处理组Bcl2/Bax的蛋白水平无明显变化,与对照组相比,差别不具有统计学意义（P>0.05）。H2O2处理组细胞内Bcl2/Bax蛋白比值下调了33%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。10 mg/LFAC处理组,凋亡效应酶caspase-3的活性无明显变化（P>0.05）。50 mg/L和100 mg/L FAC处理组,caspase-3的活性显著上调,分别上调了172.5%和307%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）。Erastin处理组,caspase-3活性未观察到变化（P>0.05）。H2O2处理使caspase-3的活性升高了284%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。5、给予MES23.5细胞铁死亡特异性抑制剂Fer-1预处理30 min后,结果显示,50mg/L FAC和100 mg/L FAC组细胞在Fer-1预处理后的GPX4蛋白水平分别是FAC单独处理组的156%和180%,与FAC单独处理组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。50 mg/L FAC和100 mg/L FAC组细胞在Fer-1预处理后的Bcl2/Bax蛋白比值分别是FAC单独处理组的141.6%和145.9%,与FAC单独处理组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。6、用100μmol/L的铁螯合剂DFO预处理MES23.5细胞30 min后,结果显示,50mg/L FAC和100 mg/L FAC组细胞在DFO预处理后的GPX4蛋白水平分别是FAC单独处理组的151%和161%,与FAC单独处理组相比,差别具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）。50 mg/L FAC和100 mg/L FAC组细胞在DFO预处理后的Bcl2/Bax蛋白比值分别是FAC单独处理组的141%和250%,与FAC单独处理组相比,差别具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。7、给予MES23.5细胞30 nmol/L的凋亡抑制剂ABT-263预处理30 min,结果显示,50 mg/L和100 mg/L FAC组细胞在ABT-263预处理后GPX4的蛋白水平是FAC单独处理组的97%和97.5%,与FAC单独处理组相比,差别不具有统计学意义（P>0.05）。50 mg/L和100 mg/L组细胞在ABT-263预处理后的Bcl2/Bax蛋白比值分别是FAC单独处理组的131%和146%,与FAC单独处理组相比,差别具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）。8、不同处理因素作用MES23.5细胞24 hrs后,10 mg/L FAC处理组Erk的磷酸化水平与对照组相比无明显变化（P>0.05）。50 mg/L和100 mg/L FAC处理组细胞的Erk磷酸化水平出现下调,分别下调了22.8%和42.6%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。Erastin处理组Erk的磷酸化水平上调了27%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。H2O2处理组细胞内Erk的磷酸化水平下调了21.2%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。10 mg/LFAC处理组JNK的磷酸化水平与对照组相比无明显变化（P>0.05）。50 mg/L和100 mg/L FAC处理组细胞JNK的磷酸化水平出现上调,分别上调了33.4%和50.4%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。Erastin处理组细胞内JNK的磷酸化水平上调了62%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。H2O2处理组细胞内JNK的磷酸化水平与对照组相比无明显变化（P>0.05）。不同处理因素对p38的磷酸化水平无明显影响（P>0.05）。9、不同处理因素作用MES23.5细胞24 hrs后,10 mg/L、50 mg/L和100 mg/L FAC组细胞内p53的磷酸化水平出现上调,分别上调了56.2%、45.7%和43.7%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.01,P<0.001）。Erastin处理组细胞内p53的磷酸化水平上调了60.2%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.001）。H2O2处理组细胞内p53的磷酸化水平上调了42.1%,与对照组相比,差别具有统计学意义（P<0.01）。10、在3月龄α-Syn A53T+/+小鼠上,观察到黑质区GPX4蛋白水平降低了25.8%,与同龄野生型相比,差别具有统计学意义（P<0.05）,Bcl2和Bax的蛋白水平无明显变化（P>0.05）。在6月龄α-Syn A53T+/+小鼠上,观察到黑质区GPX4蛋白水平下调了33%,与同龄野生型相比,差别具有统计学意义（P<0.05）,同时,黑质区Bcl2的蛋白水平下调了20%,Bax的蛋白水平上调了30%,Bcl2/Bax的蛋白比值下降了41.5%,与同龄野生型相比,差别具有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明,在铁超载引起的细胞死亡过程中,低浓度FAC即可诱导铁死亡的发生,随着FAC浓度增加,出现细胞凋亡的现象。因此,PD黑质铁选择性沉积的过程中,DA能神经元发生的铁死亡可能存在于PD早期阶段,在发生顺序上可能早于凋亡,随着铁超载程度的增加诱导细胞凋亡的发生。铁死亡抑制剂可以拮抗铁超载引起的铁死亡和凋亡,而凋亡的抑制剂不能抑制铁死亡的发生,说明在铁处理过程中,铁死亡的发生可促进凋亡的发生。铁超载诱导铁死亡的发生过程可能涉及p53信号通路,而不依赖于MAPK信号通路。在PD转基因动物模型上,首先在黑质部位观察到铁死亡相关蛋白的变化,随着病程的进展,才出现凋亡相关蛋白的改变,说明铁死亡发生在PD早期。本研究对于阐明铁死亡在PD黑质铁聚集引起的DA能神经元退行性病变中的作用和机制具有重要的科学意义,为治疗PD的提供新的潜在药物靶点。