金针菇(Flammulina velutipes(Curtis)Singer)是世界上产销量第三位的食用菌,金针菇不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养成分,而且含有多糖、脂类、糖蛋白、酚类、倍半萜等活性物质,具有多种生物活性。三相法作为新的蛋白质分离纯化技术,是一种安全有效的绿色分离方法,该方法包括盐析、等电点沉淀及溶剂沉淀等技术,将有机溶剂(一般为叔丁醇)和盐与提取液反应,离心后,混合物分为三相,其中上相为有机溶剂相(即叔丁醇相)下相为水相,中间相为蛋白相。三相分离技术可以选择性的将需要的蛋白分离到中间相,而其余的成分分配到其它相中。研究者主要将研究目标放在中间层的蛋白相和上层的油脂中,只有少量三相法应用于植物和微生物中分离活性多糖的报道,但用三相法从食药用菌中分离、纯化多糖还未见报道。1、三相法分离纯化金针菇多糖的研究以三相法提取金针菇子实体多糖的得率为目标,结合多糖纯度分析,控制参数硫酸铵质量分数、有机溶剂种类、叔丁醇的体积比、温度、pH值和料液比进行试验;在上述的单因素实验基础上,设计筛选出对得率影响最显著的3个因素:硫酸铵质量分数、叔丁醇体积比和温度;采用中心组合设计和响应面法确定了提取金针菇多糖的最优工艺:料液比1g:12mL、叔丁醇体积比1:1.9、硫酸铵质量分数37%,温度40℃,时间30min,pH=7。在上述条件下,金针菇多糖的得率为2.3%。同时,在验证试验中接近预测值(P<0.005)。由此表明,建立的响应面模型适用于优化三相法提取金针菇子实体多糖的工艺,为金针菇多糖的提取和纯化提供了新的思路。2、不同方法提取的金针菇粗多糖的理化性质及体外活性探究以金针菇子实体为原料,比较三相法和传统醇沉得到的粗多糖的得率和纯度,以及理化性质和体外活性。结果表明三相法提取的金针菇多糖相比不同醇沉得率更高(2.30%),且纯度达到40.53%;通过HPLS-MALLS-RI分析,60%醇沉和三相法纯化的多糖则较为相似;不同纯化方法得到的单糖组分总体比例接近,但三相法纯化的多糖含有糖醛酸(传统醇沉不含有或含量极低);通过DPPH、TEAC、FRAP三种抗氧化模型和NO释放量模型比较抗氧化能力和免疫活性,且发现三相法提取的金针菇多糖有较好的抗氧化活性和免疫活性。3、三相法提取的金针菇多糖的化及体外活性和结构研究以三相法提取的金针菇子实体多糖为原料,通过S-300凝胶柱进一步分离纯化得到均一多糖FVPT1、FVPT2,通过HPLS-MALLS-RI分析多糖的分子量分别为:2.06×10~4,1.64×10~4,高效阴离子色谱分析均一多糖FVPT1、FVPT2单糖组成为:岩藻糖:半乳糖:葡萄糖:甘露糖=1:3.5:1:1.4;岩藻糖:半乳糖:葡萄糖=1:3:10。通过甲基化实验,GC-MS和核磁图谱(NMR)等方法,确定金针菇均一多糖化学结构。体外细胞实验表明,FVPT1有较好的免疫活性。