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第一部分早期ARDS患者肺泡灌洗液和外周血血浆中细胞外囊泡的分离与鉴定目的:支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）和外周血血浆中的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles,EVs）与ARDS患者的肺损伤和预后相关。然而BALF和血浆中EVs分离和来源鉴定的方法目前尚无统一标准。本实验将分离提取EVs和鉴定EVs来源细胞的不同方法作对比,旨在为后续实验建立有效的分离和鉴定方法。方法:纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者。在入组后的第24h和第72h,收集患者的BALF和血浆。随后利用超速离心法（Ultracentrifugation）和尺寸排阻色谱柱方法（q EV）获得EVs。设置四种不同条件的超速离心方案:U1=超速离心100000g×2h、U2=120000g×2h、U3=120000g×70min和U4=187500×2h。通过下述三个方面比较U1、U2、U3、U4和Q（q EV）分离获得的EVs的差异。（1）纳米颗粒追踪分析仪（NTA）比较不同方法分离EVs粒径和浓度的差异。（2）使用透射电镜（TEM）和蛋白质印迹（WB）鉴定不同方法分离的EVs形态及标志。（3）将纳米流式直接检测EVs表达CD31和CD68的结果作为鉴定内皮细胞和巨噬细胞来源的金标准,比较使用乳胶微球和链霉素生物素亲和微球捕获相同的EVs后进行普通流式的检测结果与纳米流式结果。结果:1.比较不同分离方法获得EVs的粒径和浓度四种不同超速离心获取的EVs沉淀由50u LPBS重悬后,NTA检测EVs粒径与浓度结果分别为U1=（190.8nm,2.5E+12/m L）、U2=（143.68nm,1.2E+12/m L）、U3=（139.4nm,8.2E+10/m L）和U4=（121.6nm,1.0E+13/m L）;q EV法通过色谱柱收集EVs,NTA检测结果为Q=（146.7nm,3.2E+7/m L）。2.通过TEM和WB鉴定不同分离方法获得EVs四种不同超速离心方法获得EVs的TEM结果相似,镜下描述为“杯子形状”囊泡状结构,粒径大小与NTA结果相仿。U1、U2、U3和U4比较,U2分离的EVs大小和分布更均一、背景更清晰;Q分离的EVs背景较U2杂乱。WB检测不同分离方法获取的EVs表面标志性蛋白分子CD9、CD63和CD81,其分子量均与参考范围相近。3.比较不同流式方法检测EVs来源细胞的比例纳米流式检测ARDS患者血浆中EVs表征结果显示表达CD31内皮细胞源性EVs约占20%,表达CD68巨噬细胞源性EVs约占9.4%。相同样本由乳胶微球和链霉素生物素亲和微球结合EVs后,通过普通流式检测CD31和CD68的表达比例。结果发现乳胶微球法检测CD31比例（21%）与链霉素生物素亲和法相比无明显差异（19.5%）,并与纳米流式检测结果相似;乳胶微球法检测CD68比例（9%）高于链霉素生物素亲和微球法（5.8%）。结论:TEM、NTA和WB等鉴定结果显示,超速离心120000g×2h分离患者BALF和血浆中的EVs效果最佳;普通流式检测乳胶微球捕获EVs优于链霉素生物素微球。第二部分:早期ARDS患者BALF和血浆中总EVs的特征目的:比较早期ARDS患者与非ARDS患者BALF和血浆中EVs的浓度和来源细胞差异,以及ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度与ARDS病因和肺损伤严重程度的相关性。明确EVs能否作为ARDS潜在的生物标志物或治疗调节靶点。方法:纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者作为实验组,另纳入接受有创机械通气治疗的非ARDS患者作为对照组。收集入组患者的人口信息学,患者来源、基础疾病、病情严重程度、感染部位、实验室检查结果、器官功能支持等电子病历信息,在入组后的第24h和第72h,收集两组患者的BALF和血浆并记录样本体积。利用超速离心法120000g×2h分离EVs,NTA检测EVs浓度,EVs浓度表示为校正浓度,即EVs校正浓度=NTA测量的EVs浓度/样本体积。乳胶微球捕获法鉴定EVs来源细胞。结果:共有33例ARDS患者和10例非ARDS患者纳入研究。1.ARDS组和非ARDS组BALF和血浆中总EVs浓度比较1.1 ARDS组和非ARDS组基础情况ARDS组患者的年龄为65.5±15.5岁,其中男性患者18例（54.4%）,入组第一天APACHEII评分为22.8±7.4分,SOFA评分为9.2±5.1分。有创机械通气时间为11.0[6.5-23.0]天,ICU住院时间为16.0[8.0-26.5]天,总住院时间为18.0[11.0-26.5]天,28天病死率为33.3%,90天病死率为45.5%,ICU住院费用平均为16.1[8.7-30.2]万元。对ARDS的病因分类其中肺内原因23例;肺外原因10例。在感染导致的ARDS患者根据病原微生物分组为细菌性感染11例、真菌感染3例、病毒感染5例、未知病原体3例。ARDS组与非ARDS患者的性别、年龄、BMI和基础合并症（包括高血压、糖尿病、心功能不全和中枢神经系统疾病）和肝肾功能无显著的统计学差异。患者入组时ARDS组APACHEII评分、SOFA评分和降钙素原明显高于非ARDS组（P<0.05）。ARDS组的机械通气时间明显长于非ARDS组（P=0.02）,ICU住院费用明显高于非ARDS组（P=0.002）。两组患者的28天及90天病死率没有显著的统计学差异（P=0.15）。1.2 ARDS组BALF和血浆中总EVs浓度明显高于非ARDS组ARDS组BALF和血浆中总EVs平均浓度分别为5.56E+10/m L和4.63E+10/m L;非ARDS组BALF和血浆中总EVs平均浓度为1.31E+10/m L和1.72E+10/m L。ARDS组BALF中EVs浓度明显高于非ARDS组（P=0.02）;ARDS组血浆中EVs浓度明显高于非ARDS组（P=0.04）。2.ARDS组与非ARDS组BALF和血浆中EVs的来源细胞分布ARDS患者的BALF中EVs来源细胞最多为上皮细胞（23.0%）,其次为内皮细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞（21.8%、8.5%、3.9%和1.0%）;血浆中EVs来源细胞比例最高为内皮细胞（19.35%）,其次为上皮细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞（14.8%、6.1%、1.5%和0.7%）。非ARDS患者的BALF中EVs来源细胞最多为上皮细胞（22.7%）,其次为巨噬细胞、内皮细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞（16.7%、9.35%、1.2%和0.52%）;血浆中EVs来源细胞比例最高为内皮细胞（25.7%）,随后为巨噬细胞、上皮细胞、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞（17.5%、6.7%、2.1%和0.42%）。3.ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度与肺损伤严重程度的相关性根据柏林标准将ARDS患者分为轻中重三组。轻度ARDS组与中度ARDS组相比BALF中的EVs浓度无明显统计学差异（P=0.09）,轻度ARDS组比重度ARDS组BALF中的EVs浓度明显降低（P=0.02）;不同程度ARDS患者血浆中EVs浓度之间无明显统计学差异。根据P/F≥150将ARDS患者分为轻度和中重度两组,中重度ARDS患者BALF中总EVs浓度明显高于轻度ARDS（P=0.01）,两组血浆中EVs浓度无统计学差异。ARDS患者BALF中总EVs的浓度与P/F水平无关（r=-0.23,P=0.19）,血浆中总EVs浓度与P/F水平也无关（r=0.10;P=0.57）。BALF中总EVs的浓度与Murray评分水平呈现出显著正相关（r=0.43,P=0.01）;BALF中总EVs浓度与驱动压水平无关（r=0.33,P=0.06）;与静态顺应性水平也无关（r=-0.32,P=0.07）。4.不同原因导致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度的比较4.1肺内病因导致的ARDS患者BALF中总EVs浓度明显高于肺外病因研究发现肺内原因导致的ARDS患者BALF中EVs浓度明显高于肺外原因组（P=0.02）,感染原因导致的ARDS患者BALF中EVs浓度明显高于非感染组（P=0.01）,但血浆中EVs并无明显组间差异。（1）ARDS患者BALF中EVs浓度最高的肺内原因是微生物感染（7.7E+10/m L）,其次为误吸（3.8E+9/m L）;EVs浓度最高的肺外原因是不明原因（1.9E+10/m L）,其次为胰腺炎（1.43E+10/m L）、手术应激（1.4E+10/m L）、创伤（9.53E+9/m L）和烧伤（3.83E+9/m L）;（2）ARDS患者血浆中EVs浓度最高的肺内原因是微生物感染（3.5E+10/m L）,其次为误吸（1.1E+10/m L）;EVs浓度最高的肺外原因为手术应激（1.5E+11/m L）,其次为胰腺炎（7.0E+10/m L）、创伤（6.9E+10/m L）、不明原因（3.1E+10/m L）和烧伤（6.3E+9/m L）。4.2细菌性感染导致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度最高微生物感染导致的ARDS患者BALF中EVs浓度最高的亚组为细菌感染（1.36E+11/m L）,其他依次为不明病原体感染（2.5E+10/m L）、病毒感染（1.9E+10/m L）和真菌感染（1.0E+10/m L）。血浆中的EVs浓度最高的亚组同样为细菌性感染（4.8E+10/m L）,其他依次为病毒感染（2.8E+10/m L）、真菌感染（2.7E+10/m L）和不明病原体感染（7.6E+9/m L）。结论:ARDS患者较非ARDS患者BALF和血浆中总EVs浓度增高。不同细胞来源的EVs在两组间存在差异。ARDS患者BALF来源的EVs浓度随ARDS肺损伤严重程度的增加呈现出升高趋势。细菌性感染所致的ARDS患者BALF和血浆中EVs浓度最高。第三部分:早期ARDS患者T细胞源性EVs与肺损伤严重程度和预后的相关性目的:T细胞在ARDS早期的发展中具有重要作用,但目前尚无证据证明ARDS肺损伤与T细胞分泌的EVs相关。本实验旨在探讨ARDS患者肺损伤严重程度以及预后与T细胞源性EVs的潜在相关性。方法:根据柏林诊断标准纳入2020年8月至2021年4月东南大学附属中大医院重症医学科收治的ARDS患者。在入组后的第24h和第72h,收集患者的BALF和血浆。利用超速离心法120000g×2h分离EVs,NTA检测EVs浓度,乳胶微球捕获法捕获EVs后进行流式细胞仪检测CD4和CD8信号鉴定细胞来源。评估肺损伤严重程度主要指标为氧合指数（P/F）,次要指标为肺损伤评分（Murray评分）、肺驱动压（DP）和肺静态顺应性（Cst）,主要结局指标为28天病死率,次要结局指标为ICU机械通气时间和90天病死率。结果:共有33例ARDS患者纳入研究。1.ARDS组BALF和血浆中T细胞源性EVs明显高于非ARDS组ARDS组患者BALF和血浆中的CD4+T细胞源性EVs（CD4+T-EVs）高于CD8+T细胞源性EVs（CD8+T-EVs）。ARDS组患者BALF与血浆中的CD4+T-EVs比例和CD8+TEVs比例高于非ARDS组,但两组无显著的统计学差异。ARDS组BALF中两者的比例比（CD4/CD8+T-EVs）明显高于非ARDS组（P=0.016）,而ARDS组血浆中两者的比例比（CD4/CD8+T-EVs）也明显高于非ARDS组（P=0.007）。2.T细胞源性EVs与ARDS患者肺损伤严重程度无明显相关ARDS患者BALF中CD4+T-EVs与P/F无明显统计学相关性（r=-0.09,P=0.61）;CD8+T-EVs与P/F也无关（r=0.19,P=0.30）。CD4/CD8+T-EVs与P/F无显著的统计学相关性（r=-0.27,P=0.13）。ARDS患者BALF中的CD4/8+T-EVs与机械通气时间也无明显相关性（P=0.31）。3.T细胞源性EVs对ARDS患者预后有较好的预测价值ROC曲线评估APACHEII评分、SOFA评分以及CD4/8+T-EVs对28天预后和90天预后的预测价值,三者相比CD4/8+T-EVs的ROC曲线下面积最高,28天预后AUC为0.855,cut-off值为3.1。90天预后AUC为0.86,cut-off值为2.2。根据cut-off值将ARDS患者分为CD4/8+T-EVs≥3.1和CD4/8+T-EVs<3.1两组,生存曲线显示CD4/8+T-EVs≥3.1组28天病死率明显高于CD4/8+T-EVs<3.1组（P=0.026,HR=0.41[95%CI 0.18-0.94]）。而CD4/8+T-EVs≥2.2组90天病死率也明显高于CD4/8+T-EVs<2.2组（P<0.001,HR=0.23[0.07-0.75]）。结论:早期ARDS患者BALF和血浆中T-EVs浓度高于非ARDS患者。ARDS患者BALF中CD4/CD8+T-EVs与ARDS患者肺损伤严重程度成正相关,并对ARDS患者的预后有较好的预测价值。