汉坦病毒（Hanavirus，HV）属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，是有包膜的分节段负链RNA病毒，其基因组由S、M和L三个片段组成。分别编码病毒的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP人糖蛋白一lycoprotein，GI、GZ）和病毒的RNA依赖的RNA多聚酶。汉坦病毒由啮齿类动物携带，在宿主动物中产生非致病性持续性感染，但是可通过病毒污染的啮齿类动物排泄物的气溶胶等多种途径感染人类。 IV一 第四军医大学协士学位论文 人类感染汉坦病毒可导致两组严重的疾病：肾综合征出血热)（hemorrhagic fever ith rena s…ome，HFRS）和汉坦病毒肺综 合征h恤avi皿 pulmon叼 srpdrome，HPS人全球每年约有十万 例 HFRS发生，死亡率约为 2O～10O。在中国，HFRS占世界发病 总数的90％左右，是除病毒性肝炎之外危害最大的病毒性传染病。 在各种预防eRS的措施中，疫苗是最特异、最有效的一种预 防手段。迄今为止，各国学者己成功地研制出多种疫苗，为控制 HFRS的流行和预防发病提供了强有力的手段。研究发现，我国只 存在 HTN（Hantaan vlrtls，HTN）和 SEO（Seoul virus，SEO）两 种汉坦病毒。虽然存在Clethlonomys，但未见分离PUUTuumala vims，PUU)相关病毒的报道。由 HTN和 SEO所引起的肾综合征 出血热的临床表现不同、流行病学特点不同、主要动物宿主不同， 而最重要的是抗原性有较大差异，两型病毒不能很好地相互保护。 因此需要研制双价疫苗。 汉坦病毒 84FLi株是杨为松等于 1984年从肾综合征出血热患 者流产胎儿的肝脏中分离的毒株，经空斑减少中和试验（Plaque reduction neutraliZaion test，PRNT）和M片段部分基因序列分析 鉴定为汉滩病毒型（即HTN型）。该毒株是中国预防医学科学院 病毒学研究所研制的双价灭活疫苗（I型）的生产株，具有在Vero 细胞上繁殖力强，免疫原性和抗原性均较好的特点。所制备的疫 苗己被批准正式生产。测定该毒株的M片段基因组序列将有助于 了解其分子基础，从而更进一步研究其生物学特性以及致病机理。 本研究采用反转录一聚合酶链式反应（RTPCR），分节段扩增L 出 84FLi株的 L、M和 S基因片段的CDNA。直接用 PCR产物或 克隆入 pMD1载体后进行测序，获得了 84FLi株的全基因组序 v Z 第四罕医大学博士学位论文列。并将测序结果与GenBank中的其它汉坦病毒进行同源性比较，绘制系统发生树。确定了84FLi株在汉坦病毒种系发生中的位置。 测序结果表明，84FLi株全基因组的组成为L6533，M3616，S1688个核苦酸，分别编码Z151、1135和429个氨基酸。四种核昔酸组成分别为 3830A，2050C，2510G和 3447T，GC含量为39．ZIO，AT含量为61．83O。84FLi株S、M和L片段全基因序列及其推导的编码氨基酸序列 GenBank注册号分别为：AYOI 7064、AF345636和AF336826。将84FLi株的三个片段与其它汉坦病毒的核苦酸和氨基酸进行同源性比较，发现84FLi株与汉坦病毒的HTN型同源性高于其它基因型，与HTN型中国毒株的同源性也高于HTN型国外毒株。系统发生树显示，84FLi株与HTN型中国毒株RGg、Chen4等在同一个进化分支中，与HTN型国际标准毒株76－118处于不同的进化分支中。结果表明，84FLi株属于 HTh型。 采用RTPCR分两个片段扩增了84FLi株的M片段，分别克隆入 pMD丁载体中，选择两个正向插入的克隆：pMDMZ刀和PMDM石，选用 Bgl 11和 Sal进行酶切、连接，获得了一个在pMD丁载体中插入 3．6kb的 84FLi株 M基因片段全长的 CDNA克隆。利用杆状病毒表面展示系统表达汉坦病毒糖蛋白，将汉坦病毒西安分离毒株一84FLi株的＊ 和 GZ糖蛋白的编码区插入PBACsurf载体中的 gP64信号肽和 gP64成熟蛋白之间，从而构建了基于杆状病毒表面展示系统的GI和GZ糖蛋白杆状病毒表达质粒。为进一步表达糖蛋白，研究糖基化对于糖蛋白的表达量和功能的影响奠定了基础。