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研究目的:观察黄连提取物小檗碱对小鼠慢性视网膜光损伤的治疗效果,探究P2X7R在小檗碱缓解慢性视网膜光损伤小鼠中的动态变化趋势。研究方法:1.小檗碱对慢性视网膜光损伤小鼠的保护作用:选取8-10周的健康成年雄性C57BL/6J小鼠共90只,体重约20g±2,适应性喂养一周后开始进行造模。清洁级环境下饲养,随机分为空白对照组、LD组(模型组)和LD+BBR组(灌胃组)三组,其中空白组10只,LD组和LD+BBR组各40只。本次研究造模方法参考国内外使用的慢性光损伤小鼠模型,采取一种长期、低能量的蓝光照射方法,具体操作为:予LD组和LD+BBR组小鼠约500Lux±5(蓝光)、每日6:00-18:00,持续3个月的照射,每周需用UT382工业级照度计校对光源强度是否为500Lux±5。灌胃方法继续采用前期研究的灌胃方法,灌胃的具体时间周期为:在光照开始的第1天,分别对LD组和LD+BBR组进行每周连续4天,停药3天的灌胃模式,停药的目的是防止小鼠对药物及灌胃刺激产生不耐受反应。(其中LD+BBR组予配制好的小檗碱溶液灌胃,LD组予PBS缓释液灌胃。)当光照3个月结束后即光照后的第0周时,分别随机摘取空白组、LD组和LD+BBR组各6只小鼠右眼,做HE染色检测观察慢性视网膜光损伤小鼠视网膜的病理变化,并对比各组小鼠之间的组织形态学差异,根据组织形态学的变化衡量小檗碱对慢性视网膜光损伤小鼠是否有治疗效果,从而判断其对慢性视网膜光损伤小鼠视网膜的保护作用。2.小檗碱对慢性视网膜光损伤小鼠凋亡细胞的影响:实验动物的选择、造模方式、灌胃方法、饲养条件等均同研究内容1。在光照3个月结束后即光照后第0周时,摘取空白组、LD组和LD+BBR组各5只小鼠左眼进行组织取材,通过TUNEL检测法来观察小鼠视网膜细胞的阳性凋亡情况,对比不同组别小鼠视网膜阳性凋亡细胞数量,统计视网膜外核层凋亡率并进行量的比对,从而判断小檗碱是否可以抑制慢性视网膜光损伤小鼠视网膜的细胞凋亡。3.嘌呤信号P2X7R在小檗碱缓解慢性视网膜光损伤中的动态变化趋势:实验动物的选择、造模方式、灌胃方法、饲养条件等均同研究内容1。在光照结束3个月后,剩余的各组小鼠仍继续正常条件喂养,分别在光照及灌胃结束后的三个时间段,即光照后第1周、光照后第2周和光照后第3周,随机摘取正常组、LD组、LD+BBR组各6只眼球,运用实时荧光定量PCR分子生物技术来检测不同组小鼠视网膜嘌呤信号P2X7R mRNA的相对表达量,判断P2X7R是否参与了小檗碱缓解慢性视网膜光损伤的病理变化,并根据3个时间段内小鼠视网膜中P2X7R mRNA的相对表达量来分析P2X7R在小檗碱缓解慢性视网膜光损伤中的动态变化趋势。研究结果:1.HE染色法观察小鼠视网膜形态的变化:将组织进行取材、固定、脱水、包埋和切片,然后进行HE染色检测,在光学显微镜下观察空白对照组、LD组和LD+BBR组小鼠视网膜各层的结构变化,计算外核层厚度,随机选择空白组、LD组、LD+BBR组各3张切片,每张切片在400倍光学显微镜下拍摄,拍片时以视神经为中心轴,选取左右两侧两个视野进行拍摄。结果表明:空白对照组小鼠的视网膜形态未见异常,无明显病理表现,各层结构完整,神经节细胞规整排列;内、外核层细胞核形态完好、染色较均匀、紧密排列;光感受器细胞内外节边界完整、排列规整,外核层厚度为62.72±2.86 μm。LD组视网膜形态异常,各层结构发生变化,部分神经节细胞核缩小,染色变深,排列松散;内核层细胞排列略松散;外核层细胞混乱排列,可见部分细胞核出现了核的聚集、浓缩且染色变深;光感受器细胞内节和外节紊乱排列,视杆外节也出现紊乱排列,部分膜盘间隙出现断裂,测得视网膜外核层厚度为47.11 ±2.01 μm。LD+BBR组小鼠视网膜的形态出现轻度异常,神经节细胞松散排序;视网膜内、外核层细胞形态略完整、染色均匀、排列紧密;光感受器细胞内、外节排列略紊乱,外核层厚度为54.07±2.05 μm。与空白对照组比较,LD组小鼠视网膜的外核层厚度明显变薄,(P<0.01)两组具有统计学差异。与空白对照组比较,LD+BBR组小鼠视网膜外核层厚度略有变薄,(P<0.05)二者差异具有统计学意义。与LD组比较,LD+BBR组小鼠视网膜外核层厚度变厚,(P<0.01)二者差异具有统计学意义。结果说明经长期光照后使得LD组小鼠视网膜的外核层厚度变薄,而经过小檗碱灌胃治疗后的LD+BBR组小鼠其视网膜外核层厚度较LD组明显变厚,可证明小檗碱对慢性视网膜光损伤小鼠的视网膜具有保护作用。2.TUNEL观察小鼠视网膜的细胞凋亡:将切片后的组织进行TUNEL检测,采用荧光倒置显微镜分别观察空白对照组、LD组和LD+BBR组小鼠视网膜内凋亡细胞的情况,分别采用紫外光和绿色光进行激发,每组随机选取3张切片,以视神经为中心,左右两侧各选取2个视野进行拍片,分别计数各视野内视网膜外核层细胞总数和阳性凋亡细胞数,计算视网膜外核层凋亡率,结果显示:染色后的凋亡细胞呈紫红色,呈现“环形”和“新月形”等典型阳性凋亡细胞。空白对照组小鼠视网膜组织中未见有明显阳性凋亡细胞。LD组小鼠视网膜外核层出现大量凋亡细胞,凋亡率为71.16±5.99%。而经过小檗碱干预的LD+BBR组其视网膜外核层阳性凋亡细胞较LD组明显减少,凋亡率为16.02±2.68%。结果表明,经光照后LD组小鼠视网膜外核层出现大量阳性凋亡细胞,而经过小檗碱灌胃治疗后的LD+BBR组小鼠,其视网膜外核层的凋亡细胞明显变少,说明小檗碱可以抑制慢性视网膜光损伤小鼠视网膜的细胞凋亡。3.实时荧光定量PCR检测小鼠视网膜P2X7R mRNA的相对表达:将取材后的视网膜组织,进行RNA提取、cDNA制备、荧光定量PCR检测,其结果显示:与空白对照组相比,LD组小鼠视网膜中P2X7R mRNA的相对表达量出现上调,(P<0.05)二者差异具有统计学意义。与空白组相比,LD+BBR组小鼠视网膜P2X7R mRNA的相对表达量出现下调,(P>0.05)差异无统计学意义,但与LD组相比,其视网膜P2X7R mRNA的相对表达量呈现出明显下降的趋势,且(P<0.05)二者差异具有统计学意义。说明光照后会使视网膜中的P2X7R大量被激活,因此LD组小鼠视网膜中P2X7R mRNA的相对表达量升高,在小檗碱干预后LD+BBR组小鼠视网膜P2X7R mRNA的相对表达降低,说明小檗碱对P2X7R的激活有抑制作用。通过光照结束3个月后的3周内,进行3次实时荧光定量PCR检测来观察LD组和LD+BBR组P2X7R mRNA相对表达量的动态变化趋势,其结果表明:LD+BBR组和LD组在各自P2X7R mRNA相对表达量的基础上,LD+BBR组呈现略上浮的趋势,并趋于空白对照组P2X7R mRNA的相对表达量,而LD组呈现略下降的趋势,但仍高于空白对照组P2X7R mRNA相对表达量,其差异具有统计学意义(P<0.05)。以上结果说明P2X7R参与了视网膜光损伤所引发的相关病理反应,从分子生物角度来看,光损伤后LD组小鼠视网膜P2X7R mRNA表达上调,可能证明光照后激活大量的P2X7R;而在通过小檗碱干预后,LD+BBR组小鼠视网膜P2X7R mRNA的表达下调,说明小檗碱可以抑制P2X7R的激活进而对视网膜光损伤的形成起到抑制作用。研究结论:1.小檗碱对实验性慢性视网膜光损伤小鼠的视网膜具有保护作用,能够改善视网膜因光损伤而出现外核层变薄的病理损伤。2.小檗碱可以抑制实验性慢性视网膜光损伤小鼠视网膜细胞的凋亡。3.小檗碱在缓解实验性慢性视网膜光损伤小鼠的作用机制与嘌呤信号P2X7R的信号通路相关,但其确切的内在机制,仍然需要进一步研究。