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背景核转录因子кB(NF-кB)是一个广泛存在于哺乳动物细胞内的转录因子蛋白家族。P50/p65二聚体是NF-кB家族中最常见的形式。NF-кB激活后可调节多种细胞因子、免疫受体等的表达,与人类多种疾病密切相关。最近研究发现,NF-кB信号通路在机体骨质的形成、吸收及改建等方面起重要的调节作用。RANKL、TNF等细胞因子可激活破骨前体细胞的NF-кB通路,促进破骨细胞的分化和成熟,实现骨吸收。在骨质疏松动物模型中,雌激素缺乏可激活NF-кB通路,在促进破骨细胞分化成熟的同时,也抑制了成骨细胞的功能。据此我们推断,如能有效抑制NF-кB信号通路,则有望一方面抑制破骨前体细胞分化成熟,减少骨吸收,另一方面促进成骨细胞的分化,加强其成骨功能,达到治疗骨质疏松症的目的。为此,本研究针对小鼠NF-кB/p65基因,设计短发夹RNA(shRNA)靶序列,构建小鼠RNA干扰NF-кB/p65基因慢病毒载体,并感染小鼠成骨样细胞MC3T3-E1,进一步研究感染后成骨相关基因表达的变化。目的构建小鼠NF-кB/p65基因的RNA干扰慢病毒载体,感染小鼠成骨样细胞并鉴定。研究NF-кB/p65基因表达被抑制后成骨细胞功能的变化。方法针对小鼠NF-кB/p65基因序列,遵从RNA干扰序列设计原则,设计3个干扰靶点序列,根据此序列设计合成寡核苷酸序列,退火后形成分别在5’、3’端含AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位点,中间含有19个碱基发夹环的小片段DNA双链。用限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ及T4 DNA连接酶,将小鼠NF-кB/p65基因的RNA干扰序列插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,用含氨苄青霉素培养基筛选,得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒pHelper1.0、p Helper2.0转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒感染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞NF-кB/p65的表达,得到干扰效果最好的慢病毒载体。将该慢病毒感染MC3T3-E1细胞,研究对细胞增殖、凋亡的影响,并检测成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果本实验成功构建小鼠NF-кB/p65基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,NF-кB/p65基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论成功构建了小鼠NF-кB/p65基因的RNA干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞NF-кB/p65基因表达被干扰,NF-кB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。