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目的:miRNA-29(miR-29)是属于微小RNA的一种,在肾脏等组织中高度表达。本研究观察miR-29a在糖尿病肾病小鼠肾小球中的表达变化并探讨miR-29a基因敲除对小鼠肾小球功能和结构的作用。方法:Ⅰ型糖尿病模型选用C57BL/6小鼠单侧肾切除联合链脲佐菌素的方法诱导。Ⅱ型糖尿病模型选择24 w的db/db和db/m小鼠。诱导成功后用DynabeadsTMM-450 Tosylactivated微磁珠心脏灌流分离肾小球,通过实时荧光定量PCR(real time fluores-cence quantitative PCR,RT-qPCR)检测肾小球中miR-29a的表达变化。应用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠的miR-29a基因,与同种野生小鼠杂交后通过基因鉴定检测新生小鼠基因型,选择miR-29a基因敲除型小鼠作为实验组(miR-29a knockout,miR-29a KO),未敲除型小鼠作为野生型对照组(wide type,WT)。分别在第3 w、12 w、24 w收集小鼠24 h尿液和球后静脉血液。采用考马斯亮蓝染色方法定性分析小鼠是否产生蛋白尿;酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法测定尿白蛋白、尿肌酐和血尿素氮水平,并计算尿白蛋白/肌酐(urinary albumin/creatinine ratio,UACR)比值。选取3 w、12 w、24 w的小鼠,一侧肾脏采用苏木精-伊红染色法(hematoxylineosin staining,HE)、过典酸雪夫氏染色法(periodic acid-schiff,PAS)以及Masson三色染色方法观察其组织的病理变化;另一侧肾脏采用透射电镜以及冷冻蚀刻电镜观察肾小球超微结构。对24 w小鼠肾小球基底膜厚度、足细胞足突宽度以及足突数量做定量分析。另取2组24 w的小鼠,一组小鼠腹腔麻醉后用DynabeadsTMM-450Tosylactivated微磁珠经心脏灌流后分离肾小球,用于RNA和蛋白的提取;另一组小鼠脱颈处死后直接取肾脏进行OCT包埋、切片,用于肾小球免疫荧光染色。采用RT-qPCR、免疫荧光以及蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验检测小鼠肾小球足细胞标志性蛋白Nephrin、Podocin以及肾小球IV型胶原(COL4α3、COL4α4、COL4α5)和层黏连蛋白β2(lamininβ2,LAMB2)的表达。结果:RT-qPCR结果显示,与对照组相比,I型和II型糖尿病小鼠肾小球miR-29a的表达在mRNA水平显著下调(p<0.01),分别是对照组的58%和57%。肾脏功能检测结果:考马斯亮蓝染色法定性实验显示,miR-29a KO组小鼠出现尿白蛋白,WT组小鼠无蛋白尿。UACR结果显示,3 w时,miR-29a KO组小鼠未见明显变化,与WT组小鼠相比,数据无统计学差异(p>0.05);12 w时,UACR比值明显增高(1.77±0.14),与WT组(1.00±0.07)相比存在明显差异(p<0.01);24 w时,UACR比值(2.50±0.25)差异更加显著(p<0.001)。与WT组小鼠比,miR-29a KO组小鼠血尿素氮在3 w、12 w和24 w时均无显著性差异(p>0.05)。肾脏组织学染色结果:小鼠3 w时,miR-29a KO组肾小球出现轻微的细胞外基质增加和系膜基质增生,随着周龄的增加,miR-29a敲除小鼠肾小球出现纤维性胶原沉积、系膜基质扩张和基底膜增厚等变化。24 w时,上述变化程度更加显著。PAS染色显示小鼠肾小球基底膜和系膜呈紫红色,Masson染色显示肾脏胶原纤维呈蓝色,与WT组小鼠相比,miR-29a KO组小鼠肾小球呈紫红色和蓝色更为明显。肾小球超微结构观察结果:透射电镜显示,miR-29a KO组肾小球超微结构在3 w开始出现变化,包括足突排列紊乱、轻微融合等现象;12 w时,出现足突数量减少、足突融合加重和肾小球基底膜增厚;24 w时,上述变化进一步加重。对24 w小鼠基底膜厚度、足细胞足突宽度以及足突数量进行定量分析,结果显示,与WT组小鼠相比,miR-29a KO组小鼠基底膜厚度、足突宽度皆显著增加,足突数量减少(p<0.05)。肾小球足细胞及基底膜相关功能蛋白检测结果:RT-qPCR结果显示,与WT组小鼠相比,miR-29a KO组小鼠足细胞标志性蛋白Nephrin的表达在mRNA水平显著下调(p<0.05);Podocin表达在mRNA水平也呈下降趋势,但结果无统计学意义(p>0.05)。与WT组小鼠相比,miR-29a KO组小鼠肾小球COL4α3、COL4α4、COL4α5以及LAMB2表达在mRNA水平明显上调(p<0.05)。WB结果显示,与WT组小鼠相比,miR-29a KO组小鼠Nephrin和Podocin蛋白表达显著降低(均p<0.05);COL4α3/α4/α5以及LAMB2表达显著增加(p<0.01)。肾小球免疫荧光结果和WB结果一致;Nephrin和Podocin在miR-29a KO组小鼠肾小球中的表达均下调,COL4α3/α4/α5以及LAMB2的表达均上调。结论:1.miR-29a mRNA在糖尿病肾病小鼠的肾小球中表达下调。2.miR-29a基因敲除会导致小鼠出现蛋白尿、肾小球结构损伤及纤维化,随着小鼠的老龄化,蛋白尿和肾小球组织结构损伤程度加重。