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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的慢性和进行性神经退行性疾病,60岁以上人群发病率为1%,80岁以上人群发病率为4%。它是仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的第二大最常见的神经退行性疾病,其主要病理特征包括黑质（Substantia nigra,SN）多巴胺（Dopamine,DA）能神经元变性死亡、纹状体（Striatum,Str）DA释放减少及α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）的聚集。虽然PD的病因尚不完全清楚,但越来越多的证据表明,炎症和铁沉积对PD的发生和进展至关重要,阐明其在PD中的作用机制和寻找关键的生物分子可能是预防和治疗PD的新策略。脂质运载蛋白2（Lipocalin 2,Lcn2）是一种脂质运载蛋白超家族的分泌糖蛋白,参与先天性免疫反应、细胞铁转运及神经炎症的调控等。体外研究表明,Lcn2能够结合细胞外的铁并通过限制铁对细菌的可用性而发挥其抑菌作用。Lcn2在多种组织中均表达,例如大脑、肾脏、肝脏、子宫和骨髓,其受体24P3R在小胶质细胞、星形胶质细胞、上皮细胞和神经元中均有表达。Lcn2细胞表面受体的发现,提示Lcn2除了具有细胞外的抗菌功能外,可能通过其受体24P3R介导的内吞作用,参与细胞内的功能调控。但是到目前为止,Lcn2及其受体在中枢神经系统中的调控作用仍不完全清楚。有文献表明,在PD患者及动物模型中Lcn2在SN及Str的表达增加,提示Lcn2可能参与了PD的发病,但其确切的机制尚未阐明。为了阐明Lcn2及其受体在PD中可能的作用,本研究在不同的PD动物模型中检测了Lcn2和24P3R的表达变化。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的PD小鼠亚急性模型、不同月龄携带人突变型α-syn（A53T）的PD转基因小鼠模型中,应用酶联免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法和蛋白免疫印迹（Western blot,WB）等技术,观察了Lcn2和24P3R的水平变化。在脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的大鼠炎症模型中,应用行为学和蛋白免疫印迹等技术,观察了大鼠运动功能的改变,不同脑区Lcn2和24P3R的表达变化、铁转运蛋白二价金属离子转运蛋白1（Divalent metal transporter 1,DMT1）、铁转出蛋白（Ferropotin 1,FPN1）、铁蛋白轻链（light chain ferritin,L-Ferritin）及转铁蛋白受体1（Transferrin receptor 1,TFR1）的表达变化,应用电感耦合等离子-质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）技术观察各脑区铁水平的改变。此外,在葡聚糖铁诱导的高铁大鼠模型中,应用蛋白免疫印迹技术,观察SN区酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）、谷胱甘肽过氧化酶4（Glutathione peroxidase 4,GPX4）、Bcl-2、24P3R、TFR1和DMT1的表达变化。同时,在多巴胺能神经细胞PC12细胞中,应用蛋白免疫印迹和流式细胞仪技术,观察了枸橼酸铁铵（Ferric ammonium citrate,FAC）、1-甲基-4-苯基吡啶阳离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）和/或不同浓度Lcn2对细胞内Lcn2蛋白表达、铁水平和线粒体膜电位的影响。研究结果如下:1.在MPTP诱导的亚急性PD小鼠模型中,ELISA检测结果显示,与对照组相比,MPTP处理组血清中Lcn2未检测到明显改变。蛋白免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,MPTP处理组SN中24P3R的表达明显降低（P<0.05）,差异具有统计学意义。2.蛋白免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,6月龄A53T转基因小鼠SN中α-syn的表达明显升高（P<0.001）,差异具有统计学意义;6、12月龄A53T转基因小鼠SN中24P3R的表达明显降低（P<0.01,P<0.05）,差异具有统计学意义。3.ELISA检测结果显示,与对照组相比,6月龄A53T小鼠血清中Lcn2含量明显降低（P<0.05）,差异具有统计学意义;9月龄A53T小鼠血清中Lcn2含量未检测到明显改变;12月龄A53T小鼠血清中Lcn2含量明显升高（P<0.05）,差异具有统计学意义。4.在LPS诱导的大鼠炎症模型中,旷场实验结果显示,与对照组相比,LPS组总运动距离明显降低（P<0.05）,差异具有统计学意义。5.蛋白免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,SN中Lcn2、24P3R、DMT1、FPN1、L-Ferritin的表达明显升高（P<0.001,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01）,差异具有统计学意义,TFR1的表达明显降低（P<0.05）;Hip中Lcn2的表达明显升高（P<0.001）,差异具有统计学意义,24P3R、DMT1、FPN1、TFR1未检测到明显改变;Str中Lcn2的表达明显升高（P<0.001）,差异具有统计学意义,24P3R未检测到明显改变。6.在LPS诱导的大鼠炎症模型中,ICP-MS结果显示,与对照组相比,LPS处理7天SN中铁水平明显升高（P<0.05）,差异具有统计学意义。7.在葡聚糖铁诱导的大鼠高铁模型中,蛋白免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,FAC处理组大鼠SN中TH、GPX4、Bcl-2、24P3R、TFR1的表达明显降低（P<0.05,P<0.05,P<0.001,P<0.01,P<0.01）,差异具有统计学意义;与葡聚糖铁组相比,Lcn2预处理组大鼠SN中TH、GPX4、Bcl-2、24P3R、TFR1的表达明显升高（P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05）,差异具有统计学意义;而DMT1的表达未检测到明显改变。8.在PC12细胞中,与对照组相比,0.5μg/ml Lcn2+MPP+、0.5μg/ml Lcn2处理细胞4h,24h,细胞内Lcn2的表达明显升高（P<0.001,P<0.05,P<0.05）,差异具有统计学意义;MPP+和0.1μg/ml Lcn2+MPP+不影响Lcn2蛋白的表达。9.在PC12细胞中,用FAC和/或0.5μg/ml Lcn2处理PC12细胞后检测细胞线粒体膜电位及细胞内铁水平的变化。与对照组相比,FAC组、FAC+0.5μg/ml Lcn2组细胞线粒体膜电位明显降低（P<0.001,P<0.001）,细胞内铁水平明显升高（P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001）,差异具有统计学意义;0.5μg/ml Lcn2预处理细胞并不能抑制FAC诱导的细胞线粒体膜电位的降低及细胞内铁水平的升高;0.5μg/ml Lcn2单独处理并不改变细胞线粒体膜电位及细胞内铁水平。10.在PC12细胞中,用FAC和/或1μg/ml Lcn2处理PC12细胞后检测细胞内铁水平的变化。结果显示,与对照组相比,FAC组细胞内铁水平明显升高（P<0.01）,差异具有统计学意义;与FAC组相比,FAC+1μg/ml Lcn2组细胞内铁水平明显降低（P<0.01）,差异具有统计学意义。11.在PC12细胞中,用FAC和/或2μg/ml Lcn2处理PC12细胞后检测细胞线粒体膜电位及细胞内铁水平的变化。结果显示,与对照组相比,FAC组、2μg/ml Lcn2组线粒体膜电位明显降低（P<0.01,P<0.05）,差异具有统计学意义;与对照组相比,FAC组、2μg/ml Lcn2、FAC+2μg/ml Lcn2组细胞内铁水平明显升高（P<0.05,P<0.05,P<0.001）,差异具有统计学意义;与FAC组相比,FAC+2μg/ml Lcn2组细胞内铁水平明显升高（P<0.05）,差异具有统计学意义。本实验探讨了在不同PD动物模型中Lcn2和24P3R的表达变化。结果提示,在不同的PD动物模型中,血清中Lcn2的含量及24P3R的表达存在差异;在LPS诱导的大鼠炎症模型中,仅在SN中观察到Lcn2和24P3R的表达同时增加,以及铁转运蛋白异常表达,提示Lcn2,24P3R及铁转运蛋白的表达异常可能参与了LPS诱导的SN铁沉积,同时在LPS处理7天时SN出现特异性铁沉积。而外源性Lcn2在急性高铁模型中能够通过抑制铁沉积,从而保护多巴胺能神经元免受高铁介导的神经元损伤。体外实验证实,外源性Lcn2在一定范围内能够降低铁诱导的细胞内铁水平的升高,但过高浓度的Lcn2可能通过增加细胞内铁水平加重神经元损伤。研究结果为PD的铁沉积与Lcn2之间的相互联系提供了实验基础。揭示Lcn2在PD发病中的机制,寻找靶向Lcn2的治疗方法可能是PD防治的新思路。