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背景痤疮丙酸杆菌(Cutibacteriumacnes,C.acnes)的感染是促进痤疮发生发展的重要因素之一。针对C.acnes的感染,以抗生素和维A酸为基础的药物已作为重度痤疮痤疮的一线治疗方法,但是随着细菌耐药性的增加及维A酸类药物的相关不良反应,临床上需要新的更安全有效的治疗手段。5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-aminolevulinic acid photodynamictherapy,ALA-PDT)是一种新兴的药械结合治疗方法,在多个医学学科领域得到广泛应用,尤其是中重度痤疮的治疗,然而,ALA-PDT治疗痤疮的作用机制尚未十分明确。本研究旨在明确ALA-PDT对C.acnes的体外抑制作用及对兔耳痤疮模型皮损组织中IL-17表达水平的影响。目的1.明确ALA孵育C.acnes最适药物浓度、敷药时长,及不同照光剂量ALA-PDT对C.acnes的抗菌效应,建立ALA-PDT治疗细菌感染的最佳参数;2.建立兔耳痤疮模型,探讨ALA-PDT对兔耳痤疮模型皮损治疗效果和ALA-PDT治疗前后皮损组织中IL-17表达水平及其调控机制。方法1.明确PpIX荧光强度与药物浓度和敷药时间的关系实验分为对照组和实验组,对照组为C.acnes菌悬液,实验组选用不同浓度ALA(0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL)孵育C.acnes菌悬液,各组均于37℃恒温培养箱中孵育0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h,多功能酶标仪分别检测各时间点PpIX荧光强度,检测后实验组样品分别接种于BHI固体培养基表面培养并进行菌落计数。通过检测不同浓度ALA作用于细菌不同孵育时间后的PpIX荧光强度,确定ALA-PDT对C.acnes抗菌效应的最佳实验参数(光敏剂ALA浓度和敷药时长)。2.确定不同照光剂量ALA-PDT处理C.acnes的抗菌效应根据第一步实验结果选择最佳ALA浓度及孵育时间,将实验分为四组:第一组为空白对照;第二组为单药组;第三组为单光组;第四组为ALA-PDT组。第三组和第四组分别予以不同剂量(0、20、40、80、100J/cm2)的红光(632±7 nm)照射,第一组、第二组不予照光,各组样本分别通过菌落计数、活死染色、透射电镜评价不同照光剂量ALA-PDT对C.acnes的体外抑制效应。3.建立兔耳痤疮模型选用新西兰家兔,于兔耳内侧面皮内注射新鲜配制的C.acnes菌悬液(3×108个/mL),隔日进行,共计21天,诱导痤疮样皮损,为进一步研究ALA-PDT对痤疮动物模型皮损及其炎症因子的影响提供研究模型。4.检测ALA-PDT治疗前后兔耳痤疮模型皮损的改变和组织中IL-17的表达水平,并初步探讨ALA-PDT影响痤疮皮损中炎症因子变化的机制研究通过肉眼观察、组织病理学评价建模结果,将建模完成后的家兔随机分为两组,分别为ALA-PDT组和无干预组,通过观察治疗前和治疗后4h、24 h、4 d、7 d皮损大体表现及组织病理改变评价痤疮炎症变化趋势。同时,采用Real-time PCR检测ALA-PDT治疗前和治疗后4h、24h、4d、7dIL-17的表达及其上游关键转录因子RORα和RORγt的表达水平。结果1.PpIX荧光强度与药物浓度和敷药时间的关系实验组孵育0h、1h、2h、4h、8h、12h荧光强度无明显改变,12h、24h荧光强度轻微升高,48h后荧光强度明显升高;对照组荧光强度随着孵育时间延长,荧光强度未见明显改变,。因此选择48h为ALA孵育C.acnes适宜孵育时间。同时,不同浓度ALA孵育C.acnes 48h,ALA浓度为0.5mg/mL时荧光强度高于其他浓度组(p<0.05)。2.不同红光剂量ALA-PDT对C.acnes的抗菌效应菌落形成单位(Colony-formingunits,CFU)计数结果显示,单光组20J/cm2、40 J/cm2、60 J/cm2对C.acnes无明显抑制作用,当照光剂量达到80 J/cm2、100J/cm2时,C.acnes存活数量明显减少(p<0.05)。ALA-PDT组照光剂量为20-100 J/cm2各剂量均明显抑制C.acnes数量,且随着照光剂量增加,ALA-PDT杀菌效应越明显(pp<0.01)。细菌活死染色示ALA-PDT随着照光剂量增加,C.acnes存活率逐渐降低。电镜结果显示,ALA-PDT处理后,细菌的细胞壁、细胞膜及细胞质结构受损。3.兔耳痤疮模型的建立兔耳皮内注射C.acnes菌悬液可诱导痤疮样皮损,可见注射区域出现丘疹、毛囊口扩大伴脂栓、部分脓肿,能较好模拟痤疮样的皮损,为进一步研究ALA-PDT治疗痤疮及对炎症因子的影响提供了动物模型。4.ALA-PDT对兔耳痤疮模型皮损治疗效果和治疗前后组织中IL-17表达水平及初步机制皮损大体表现,ALA-PDT组在治疗后4h、24h皮损区炎症较治疗前有所加重;治疗后4d组织淋巴细胞浸润较4h、24h减轻;治疗后7d皮损好转明显且优于自身治疗前及无干预组。Real-time PCR研究结果发现ALA-PDT组IL-17、RORcα、RORγt表达水平在治疗后4h逐渐升高(p=0.0819;pp=0.0296;p=0.0426),24h后进一步升高(p=0.0018;p=0.0006;p=0.0027),治疗后 4d 表达水平较前降低(p=0.2066;p=0.0286;p=0.1945),治疗后7d表达水平较治疗前显著降低(p=0.0224;p=0.0027;p=0.0233)。结论1.C.acnes能吸收ALA并转化为PpIX,ALA-PDT体外对C.acnes有明显抑制作用,当ALA浓度为0.5mg/mL、孵育48h,随着照光剂量加大,抑菌效果越强。ALA-PDT抑菌可能通过破坏菌体结构发挥作用。2.ALA-PDT体外抑菌参数与临床治疗痤疮参数(ALA浓度5%,敷药3 h)差别迥异,推测临床ALA-PDT治疗痤疮可能不是通过直接杀灭C.acnes发挥疗效。3.C.acnes菌悬液可诱导兔耳痤疮模型,皮损可模拟临床痤疮皮损,可作为ALA-PDT治疗痤疮机制研究模型。4.ALA-PDT对痤疮皮损有明显改善作用,早期通过上调IL-17放大炎症反应,随后下调IL-17,最终有效治疗痤疮,这一调控作用可能通过两个关键转录因子RORα和RORγt实现。