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目的:已有前期基础研究明确六味地黄汤可通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路改善纤维化,但上游调控机制未完全明了。研究显示Klotho参与TGF-β1/Smad2信号通路调控,本研究拟从Klotho角度探讨六味地黄汤改善肾脏纤维化的具体作用机制,为其临床治疗CKD提供新的思路和可靠的实验依据。方法:将60只SPF级SD大鼠,采用5/6肾切除方法建立慢性肾衰竭大鼠肾纤维化模型,分为空白组、假手术组、模型组、六味地黄汤、依那普利组。五组治疗疗程均为8周。8周后取大鼠血、尿及肾脏标本。运用生物化学法评价各组大鼠肾功能变化;HE染色评价肾小管间质损伤指数;Masson染色评价肾小管间质胶原面积百分比;免疫组织化学方法检测Klotho、TGF-β1、p-Smad2各蛋白的表达。探讨六味地黄汤通过调节Klotho/TGF-β1/Smad2信号通路来减轻肾纤维化的假说。结果:1.造模后,与空白组、假手术组比,其余各组大鼠体重增长相对较小;与模型组比,药物治疗组大鼠体重增长较大,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。六味地黄丸组和依那普利组相比,体重变化差异无统计学意义(P>0.05)。2.与假手术组比,各造模组大鼠24h UAlb、Scr、BUN均明显增多,肾功能较差(P<0.05)。与模型组比较,药物干预组大鼠24h UAlb、Scr、BUN明显降低,肾功能有所恢复,各组间差异都具有统计学意义(P<0.05)。与依那普利组比较,六味地黄汤组大鼠24h UAlb、Scr、BUN水平差异无统计学意义(P>0.05)。3.H.E染色示:空白组、假手术组肾脏形态结构正常,模型组肾脏病变较重,以肾间质部改变最为显著,六味地黄汤组及依那普利组肾小球、肾小管-间质部病变较模型组显著减轻。模型组肾小管间质损伤指数较假手术组和药物治疗组差异有明显统计学意义(P<0.01),六味地黄汤组肾小管间质损伤指数较假手术组升高,但较模型组下降明显(P<0.01)。4.Masson染色示:空白组、假手术组和各药物治疗组可见微量或少量蓝色胶原沉积。模型组有大量蓝色胶原沉积。肾小管间质胶原面积百分比定量分析,模型组明显高于假手术组和各药物治疗组(P<0.01),而六味地黄汤组肾间质损伤程度较依那普利组更为显著(P<0.01)。5.免疫组化:模型组肾脏Klotho蛋白较假手术组明显减少(P<0.01),TGF-β1、p-Smad2的表达较假手术组和各药物组明显增多(P<0.01),六味地黄汤组的肾脏Klotho蛋白较模型组组有所增加(P<0.01),TGF-β1、p-Smad2的表达较模型组有所下降(P<0.01)。6.Klotho与TGF-β1、p-Smad2蛋白的表达两两间呈显著性负相关关系(p<0.0001),TGF-β1与p-Smad2蛋白的表达呈显著性正相关关系(p<0.0001)。结论:(1)六味地黄汤可改善5/6肾切除大鼠的肾功能和减轻肾脏病理损害,具有保护和修复肾脏组织的作用。(2)六味地黄汤抑制了5/6肾切除大鼠促纤维化过程中TGF-β1/Smad2信号通路的表达,具有改善细胞外基质积聚的作用。(3)六味地黄汤延缓肾间质纤维化的作用机制可能与其上调Klotho蛋白水平,从而抑制TGF-β1蛋白表达,减少Smad2的磷酸化有关,即六味地黄汤可抑制5/6肾切除大鼠Klotho/TGF-β1/Smad2信号通路,从而保护肾脏。