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研究背景:“情志致病”是中医病因学重要组成部分,强烈的情志刺激能够影响机体的阴阳气血及脏腑的生理平衡,导致各种疾病的发生。“怒”是最常见的情绪表现之一,中医理论认为肝在志为怒,“怒伤肝”,过激的的情绪容易导致“肝”系统发生紊乱,导致病变。课题组前期建立了拘束应激诱导肝损伤的模型,也初步发现在该模型中小鼠肝组织存在脂质过氧化,但具体机制不明。本研究在预实验过程中,发现拘束应激负荷同时可能引起小鼠肝组织生物节律的改变。因此,本课题拟从磷脂过氧化作用的角度探讨生物节律因子在情志应激诱导肝损伤中的作用,阐明“怒伤肝”的生物学机制,并利用该模型评价中药复方柴胡疏肝散的作用。研究结果将丰富中医“情志致病”理论,为进一步使用现代生物学基础解释中医情志致病理论以及采用疏肝解郁中药/复方辅助治疗肝损伤的应用和推广提供实验基础。研究方法:（1）采用拘束应激建立小鼠肝损伤模型,采用天门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase,ALT）试剂盒检测小鼠血清中AST、ALT的水平变化;采用苏木素-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,H&E）检测小鼠肝损伤的病理特征;采用丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒、Western Blot技术和LC-MS法分别检测小鼠肝脏组织中磷脂过氧化产物MDA、4-HNE（4-Hydroxynonenal）和抗氧化物谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的水平,同时使用LC-MS/MS法进一步分析应激小鼠肝脏中磷脂过氧化水平以及氧化型磷脂组成的变化。此外,采用q-PCR、Western Blot技术分析拘束应激小鼠肝脏组织中节律因子的表达水平变化,确定情志应激诱导的肝损伤中生物节律的变化。（2）通过构建生理型节律紊乱（Circadian disruption）动物模型,采用MDA试剂盒、Western Blot技术、LC-MS法检测小鼠肝脏组织中磷脂过氧化产物MDA和4-HNE、抗氧化物GSH的水平,验证生物节律与磷脂过氧化的联系。随后,在人源肝细胞株Hepa RG中过表达BMAL1,利用C11-BODIPY染料、LC-MS/MS方法在细胞水平上探讨BMAL1与磷脂过氧化水平的关系,并利用q-PCR和Western Blot技术检测磷脂过氧化相关基因和蛋白的表达水平,确定BMAL1与磷脂过氧化作用中的关键酶——脂氧合酶15（Arachidonate 15-lipoxygenase,ALOX15）存在相互关系。利用双荧光素酶报告基因实验和凝胶电泳迁移实验进一步考察BMAL1与ALOX15的相互作用和调控机制。（3）利用上述建立的情志应激诱导的肝损伤模型,评价和探讨中医经典复方柴胡疏肝散在缓解情志应激诱导的肝损伤的作用及其机制。研究结果:实验结果发现,与正常小鼠相比,拘束应激小鼠血浆中ALT、AST水平显著增加（p<0.05,p<0.001）,病理组织切片也显示小鼠肝组织出现明显损伤;其肝脏组织的磷脂过氧化水平增加,MDA（p<0.001）和4-HNE水平显著增高,GSH水平显著下降（p<0.05）。通过LC-MS/MS法进一步分析应激小鼠肝脏中磷脂过氧化水平以及氧化型磷脂组成的变化,结果显示拘束应激使小鼠肝脏中过氧化磷脂发生累积,氧化型磷脂的含量显著增加（p<0.05）。以上实验结果提示,拘束应激诱导的肝损伤中发生了磷脂过氧化。此外,拘束应激也导致小鼠肝组织的节律基因Bmal1、Rev-erbα和Per2的节律性发生明显的变化,其中BMAL1的表达水平显著增加（p<0.01）。为进一步研究生物节律如何参与肝损伤中的磷脂过氧化过程,我们建立了生物节律紊乱模型,实验结果显示,与正常组小鼠相比,生物节律紊乱小鼠肝组织中的4-HNE水平明显增加（p<0.05）,MDA水平显著增加（p<0.001）,同时GSH的含量显著下降（p<0.001）,表明生物节律紊乱确实会导致肝脏磷脂过氧化增加。在体外细胞模型中,过表达BMAL1显著增加Hepa RG细胞磷脂过氧化物水平（p<0.01）和磷脂过氧化终产物4-HNE（p<0.05）的水平。氧化脂质组学实验结果也显示,过表达BMAL1的Hepa RG细胞过氧化磷脂发生累积,增加氧化型磷脂的含量。对磷脂过氧化信号通路相关基因进行筛选发现,过表达BMAL1显著增加ALOX15的表达（p<0.01）。这些结果说明BMAL1可能通过影响ALOX15增加肝细胞的磷脂过氧化水平。进一步的双荧光素酶报告基因实验和凝胶电泳迁移实验结果显示,BMAL1可以结合ALOX15的启动子序列中的E-BOX序列,直接参与转录调控ALOX15而增加其表达水平。采用情志应激诱导肝损伤模型评价和探讨柴胡疏肝散的护肝作用及机制,结果显示高剂量的柴胡疏肝散可显著降低应激小鼠血清中ALT（p<0.001）和AST（p<0.001）的水平,同时显著改善小鼠肝组织的病理损伤,减少炎性浸润。MDA试剂盒和Western Blot数据结果显示,低、高剂量的柴胡疏肝散可明显降低应激小鼠MDA（p<0.001,p<0.001）的水平,同时高剂量的柴胡疏肝散可明显降低应激小鼠4-HNE（p<0.01）的水平。LC-MS数据结果显示,低、高剂量的柴胡疏肝散显著增加应激小鼠肝脏组织的GSH水平（p<0.001,p<0.001）,并且呈现一定的剂量依赖性。q-PCR实验结果显示,高剂量柴胡疏肝散可明显降低急性应激小鼠肝脏组织中Bmal1和Alox15的基因表达水平（p<0.01,p<0.01）。因此,柴胡疏肝散的护肝作用机制可能是通过下调小鼠肝脏中的Bmal1和Alox15基因表达水平,抑制磷脂过氧化作用而缓解肝损伤。研究结论:拘束应激诱导的肝损伤中存在明显磷脂过氧化,其可能机制是拘束应激导致节律因子BMAL1升高,从而直接靶向调控磷脂过氧化的关键酶ALOX15的表达,增加肝组织中的磷脂过氧化水平导致肝脏损伤。中药复方柴胡疏肝散可通过下调小鼠肝脏中的Bmal1和Alox15基因表达水平,抑制磷脂过氧化,从而缓解情志应激诱导的肝损伤。