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P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp,编码基因Abcb1）不仅介导肿瘤细胞的耐药性,而且与药物在机体内的吸收、分布、代谢和排泄有关,并可介导药物间的相互作用,近年来引起了众多药剂学研究者的关注,相关研究也成为该领域的热点。目前有关人和啮齿类动物P-gp的相关研究逐渐增多,但对猪P-gp的表达、调控和功能的相关研究仍较匮乏。本文首先克隆了猪P-gp的编码基因Abcb1并进行生物信息学分析,对P-gp在健康仔猪不同组织中的表达进行探究;然后将猪Abcb1基因转染MDCK细胞,构建稳定表达猪P-gp的稳转细胞系并利用该细胞系研究了猪P-gp对恩诺沙星和伊维菌素跨膜转运的影响。基于上述研究,我们进一步探讨了猪Abcb1基因的基础转录调控机制以及LPS对P-gp表达的影响。主要研究内容和结果如下。1.猪P-gp的编码基因Abcb1的克隆及其在猪不同组织中的表达水平本实验首次克隆猪Abcb1基因的编码区,对其进行生物信息学分析,并采用qRT-PCR和Western blot方法检测了 P-gp在健康仔猪不同组织中的表达差异。结果显示猪Abcb1基因CDS全长为3861 bp,编码1286个氨基酸,未糖基化时蛋白分子量为141.966 kDa。序列比较分析显示,猪Abcb1基因与其他物种在核苷酸水平及氨基酸水平上均表现出较高的保守性,含有ABC转运体的特征结构:Walker A-,WalkerB-和Walker C-序列。遗传进化方面,猪Abcb1与牛、羊Abcb1遗传进化距离最近。蛋白跨膜结构分析发现猪P-gp与人P-gp具有相似的跨膜结构,提示其与人P-gp具有相似的生物学功能,但I-TASSER预测分析发现猪P-gp存在14个底物结合位点,分别位于TMD1的跨膜5、6和TMD2的跨膜7、11、12区域,而人P-gp的底物结合位点位于TMD1的跨膜5、6和TMD2的跨膜11、12区域,该差异可影响其底物类型。采用qRT-PCR及Western blot方法检测了 P-gp在猪不同组织中的表达情况,结果显示P-gp在健康仔猪不同组织的表达量存在较大差异,其在脑毛细血管、空肠、回肠、肝脏中的表达量较高,而在十二指肠、盲肠、结肠、直肠中较低,在大脑皮层、中脑、下丘脑、海马、小脑、肾脏中几乎检测不到。P-gp在健康仔猪吸收和代谢器官及脑血管中的高量表达和分布,提示其可能对一些口服药物或毒物的吸收、排泄及在脑的分布产生影响。2.MDCK-pAbcb1细胞的构建及其对恩诺沙星、伊维菌素跨膜转运的影响本部分实验利用含有G418抗性基因的pcDNA3.1（+）载体,在启动子下游的Xho I和Xba I两个限制性内切酶位点之间插入猪Abcb1基因,成功构建了pcDNA3.1-pAbcb1质粒。通过绘制G418耐受细胞生长曲线,确定500 μg/mL的G418作为最佳抗性筛选浓度。最后利用Lipofectamine2000将构建的pcDNA3.1-pAbcb1转染至MDCK细胞,用500 μg/mL的G418进行筛选并进行单克隆操作,初步筛选到3株单克隆细胞。经RT-PCR和Western blot验证,筛选到可高量表达猪P-gp的单克隆株,暂命名为MDCK-pAbcb1。最后采用底物蓄积实验,利用流式细胞术检测了 MDCK细胞和构建的MDCK-pAbcb1对底物Rho123的蓄积情况,结果表明:MDCK-pAbcb1细胞对Rho123的蓄积量在15、30、60和120 min时均显著低于对照的MDCK细胞（P<0.05）,且实验体系中加入P-gp抑制剂维拉帕米后MDCK-pAbcb1细胞内Rho123的蓄积量会显著增加（P<0.05）,而对照细胞MDCK变化不显著。上述结果表明过表达猪P-gp的MDCK-pAbcb1细胞构建成功,且该细胞具有外排底物的生物学活性,可用于后续猪P-gp底物的筛选。MDCK细胞和构建成功的过表达细胞MDCK-pAbcb1在Transwell小室上生长5天后,电阻值可持续稳定超过150 Ω·cm2,表明这两种细胞能形成致密的单层细胞,可用来模拟肠道对药物的吸收及转运。MTT细胞毒性试验显示:18 μM的恩诺沙星对MDCK细胞活力有显著影响,而对MDCK-pAbcb1细胞的活力没有影响,因此选择12 μM的恩诺沙星用于后续试验;0、0.01、0.1、0.5、1μM的伊维菌素对MDCK及MDCK-pAbcb1细胞活力均没有显著影响,因此选择1 μM的伊维菌素用于后续试验。药物的双向转运试验表明:MDCK-pAbcb1细胞对恩诺沙星的外排率为2.58,显著高于MDCK细胞的外排率（1.04,P<0.05）,添加P-gp的抑制剂维拉帕米后,其对恩诺沙星的外排率（1.24）显著低于不加抑制剂组（P<0.05）;过表达细胞对伊维菌素的外排率为3.79,P-gp抑制剂维拉帕米可显著降低其对伊维菌素的外排率（1.29,P<0.05）。上述结果表明恩诺沙星和伊维菌素为猪P-gp的底物,在临床使用时应考虑P-gp对上述两个药物体内过程的影响。3.猪Abcb1基因核心启动子筛选及Sp1转录因子对Abcb1表达的影响P-gp在不同的生理及病理条件下,其表达存在差异,造成这种差异的一个重要原因是其转录水平不一致导致的。目前,有关猪Abcb1基因的转录调控机制尚未见报道。本实验首次通过5’-RACE确定了猪Abcb1基因的转录起始位点（TSS）,利用猪基因组DNA获得了 1905 bp的5’-非翻译区,并预测了转录因子结合位点和CpG岛。结果显示猪Abcb1基因的5’-非翻译区存在AP1、CEBPα、CEBP β和Sp1等转录因子的结合位点,并存在2个CpG岛。通过构建一系列启动子截短片段质粒,采用双荧光素酶报告系统检测证实猪Abcb1基因启动子的195～+25 bp为核心启动子区,可决定该基因的基础转录水平。在核心启动子区存在多个Sp1转录因子结合位点,定点突变-61/-51 bp和-43/-31 bp位点后均能显著降低启动子的活性,证实Sp1转录因子的主要结合位点存在于该区域。siRNA干扰细胞内的Sp1转录因子可显著降低猪Abcb1基因的启动子活性,并能影响P-gpmRNA及蛋白表达水平（P<0.05）。最后通过CHIP证实,细胞内的Sp1转录因子可与猪Abcb1基因的启动子结合。上述结果表明Sp1转录因子可以与Abcb1基因的核心启动子区的Sp1转录因子结合位点结合,从而正向调控猪Abcb1基因的转录。4.LPS对猪P-gp表达的影响研究显示P-gp的表达和活性可受外界因素影响,进而导致药物的体内过程发生变化或引起药物的不良反应。本实验采用体外方法研究了 LPS诱导的炎症对猪P-gp表达的影响及其作用机制。我们首先通过MTT实验筛选了 LPS对细胞生长无显著影响的安全剂量范围（1～10 μg/mL）,采用ELISA方法检测了 LPS刺激后细胞上清中炎症因子的变化,发现LPS对IL-1 β和IL-6的分泌无显著影响,但使IL-8的释放显著增加（P<0.01）。利用qRT-PCR和Western blot方法检测到不同浓度的LPS（1,2,5,10）处理细胞会导致猪Abcb1的表达下降（P<0.05）且呈现出明显的浓度依赖性。进一步采用Western blot和免疫荧光法检测证实LPS处理可使IPEC-J2细胞中p65的磷酸化水平升高并检测到p65的入核,表明LPS可激活IPEC-J2细胞的NF-κ B通路,而抑制NF-κ B通路可逆转LPS对猪Abcb1基因的下调,初步证明LPS通过NF-κ B通路降低猪Abcb1的表达。利用PXR的激动剂利福平及过表达PXR证明PXR可促进猪Abcb1基因的表达。综上所述,本研究成功克隆了猪Abcb1基因并对其在猪不同组织中的表达水平进行检测;成功构建了过表达猪Abcb1基因的MDCK-pAbcb1细胞系并用于P-gp底物的筛选;初步阐明了 Abcb1基因的转录调控机制及LPS对其表达的影响和调控机制。该研究进一步完善了猪P-gp的表达调控理论,并为猪临床合理用药提供理论依据,故具有重要意义。