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研究背景:
癫痫(epilepsy, EP)是神经系统常见慢性疾病,患病率为0.4％-1％。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)是成人局灶型癫痫中最常见且最易出现耐药性的类型,约占癫痫病人的50％,其中大部分患者病变部位位于海马和杏仁核。谷氨酸(glutamate, Glu)是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质,生理状态下参与神经冲动的传导并调整其效率；病理状态下导致神经元兴奋性升高并产生毒性；谷氨酸转运体(glutamate transporters or excitability amino acid transports,EAATs)是一组位于神经元和胶质细胞膜上的糖蛋白,在生理状态下,它能迅速转运突触间隙中的谷氨酸,保持细胞外谷氨酸处于适当的水平。作为生理状态下清除细胞外谷氨酸的重要机制,对维持信号在突触间的正常传递发挥着重要作用。在某些病理状态下(缺血、缺氧等),谷氨酸转运体不但在表达上发生改变并且通过逆向转运的方式增加谷氨酸的释放。神经元的变性及凋亡和异常神经网络的形成是癫痫发病机制及发展过程的主要原因。谷氨酸含量的增多导致的神经毒性在其中起着决定性的作用。因此,谷氨酸-谷氨酸转运体共同影响细胞外谷氨酸水平并与谷氨酸受体协同影响神经元和胶质细胞的生理状态。目前,在对癫痫的发生机制和发展过程的研究中,对谷氨酸及谷氨酸受体的研究较为透彻,但对谷氨酸转运体的研究,特别是谷氨酸转运体对癫痫病程中突触可塑性(synaptic plasticity)和空间认知性能(spatial cognitive)的影响,既往研究的较少。因此,明确谷氨酸转运体在期间的表达及功能变化,有助于进一步了解癫痫的发病机制及发展过程,为治疗癫痫提供新的思路。
目的:
本实验采用国际公认的Li-PILO化学点燃模型,给予谷氨酸转运体抑制剂消旋-苏-β-苯甲氧天冬氨酸(DL-Threo-Benzyloxyaspartate, DL-TBOA)干预,分别在不同时段采集电生理学(脑电图,EEG及长时程增强,LTP)、行为学(Morris水迷宫,MWM)及病理学(Fluoro-Jade-B染色)资料,来观察癫痫大鼠模型脑内谷氨酸转运体突触可塑性的动态变化与外在症状和行为学之间的联系,旨在进一步揭示其在癫痫发病发展中的作用及对认知的影响。
材料与方法:
采用Li-PILO化学点燃模型,32只采用雄性Wistar大鼠,随机分为五组：短期癫痫实验组(short-term seizures group, SE组)和其对照组(short-term controlgroup, SC组),长期癫痫实验组(long-term seizures group, LE组)和其对照组(long-term control group, LC组)及健康大鼠对照组(sham组),大鼠建模14d后,SE和LE组大鼠的右侧海马内注射谷氨酸转运体抑制剂TBOA,SC和LC组大鼠的相同部位注射相同剂量人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF)。脑内注射10min后(SE组、SC组)及脑内注射后两个星期(LE组、LC组)做海马区穿通纤维通路(perforant pathway, PP)和齿状回(dentate gyrus, DG)通路的LTP测定,并在LTP前先同步记录各组大鼠海马DG和PP区神经元自发脑电。脑内微量注射后一个星期进行MWM实验(LE组、LC组),应用MWM系统对实验动物进行行为学实验。实验结束后取脑,行Fluoro-Jade-B染色。
结果:
脑电复杂度分析:DG部位的脑电最大李雅普诺夫氏指数(largest Lyapunovexponent, LLE)SE组与LE组相比较具有统计学差异(P<0.05);脑电功率谱(EEGpower spectrum)分析在给予TBOA 10min后,SE组的θ波段能量较SC组明显下降(P<0.05)。
LTP(long-term potentiation):LE与Sham组相比,EPSP的斜率和PS的幅值显著增加(P<0.05;P<0.01);LE与LC组相比,EPSP的斜率和PS的幅值显著增加(P<0.01;P<0.05),PS的潜伏期明显缩短(P<0.05);LC与Sham组相比,EPSP的斜率显著降低(P<0.05);
MWM定向航行实验中,LE组总逃避潜伏期和总游泳距离较LC组及Sham组长(P<0.01;P<0.05),LE组较多采用较为初级的搜索策略且策略转变较LC慢。空间探索实验中,在穿越平台次数和第三象限游泳时间百分比两个方面,LE组和LC组没有统计学差异(P>0.05)。
病理学:Fluoro-Jade-B染色是一种特异性标记变性神经元的荧光染色。在TBOA干预4小时,SE组的变性细胞明显多于SC组。在TBOA干预2周后,LE组和LC组组织结构均有明显改变,失去齿状回正常结构层次,而且,在LE组可观察到神经元变性依然持续,荧光着色细胞明显多于LC组。
结论:
1、给予TBOA后,脑电功率谱分析结果显示SE组出现低频能量降低、高频能量升高的兴奋状态,提示谷氨酸转运体在减少癫痫大鼠模型的神经元过度兴奋及维持脑电的复杂度方面发挥着积极的作用。
2、给予TBOA后,检测LTP,SE组与SC组没有统计学差异,然而LE组和LC组在EPSP的斜率和PS的幅值都具有统计学差异。提示谷氨酸转运体不能即时的改变癫痫大鼠模型的突触可塑性,但在其缺损情况下,至少在2周内即出现细胞和组织水平的生物电同步性升高,且存在神经兴奋的异常扩布,导致LTP为代表的突触可塑性的升高。
3、给予TBOB后,LE组在MWM获得阶段成绩下降,而在保持阶段与LC组没有显著性差异。说明在癫痫大鼠模型,谷氨酸转运体影响大鼠对空间信息的获取效率,但海马局部的谷氨酸转运体功能障碍不影响2周内空间信息的保存和再提取。
4、给予TBOA后,SE组和LE组Fluoro-Jade-B染色显示变性细胞增加。提示谷氨酸转运体将减少癫痫大鼠模型因癫痫所致的神经元变性、死亡和再生及异常神经网络形成,维持相应脑区组织和细胞水平的结构稳定,阻止神经冲动沿异常网络传导。