油菜与拟南芥中MAPK级联途径应答逆境的分子机制研究

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甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界范围内一种重要的油料作物,其油菜籽的品质和产量经常受到环境胁迫如盐害、干旱和病原微生物的影响。其中,核盘菌是一种重要的植物腐生性病原真菌,可以引起包括油菜在内的多种植物的茎腐病;因此,挖掘响应及耐受核盘菌侵染的基因非常重要。有丝分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase,MAPK/MPK)通过三级磷酸化级联途径传递外界信号,引起一系列的生理生化反应以及下游应答基因的表达,最终调控植物抗逆或者生长反应。目前,对油菜中MPK和其上游的MPK激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase,MKK)以及下游WRKY转录因子的鉴定及其功能解析还比较少。在前期研究中,本实验室对油菜中的7个MKK和12个MPK成员进行了克隆。本文利用生物化学和分子生物学技术进行了鉴定分析,借助绿色荧光蛋白(GFP)对油菜的两个MKK,一个MPK及一个WRKY在烟草中进行了亚细胞定位分析,发现它们分别定位于细胞核和/或细胞质内。进一步通过酵母双杂交(Yeast two-hybrid,Y2H)分析了MPK与MKK及WRKY之间的相互作用,结果发现了几个新的互作模块: BnaMKK9-BnaMPK1/2-BnaWRKY53,BnaMKK2/4/5-BnaMPK3/6-BnaWRKY20/26,BnaMKK9-BnaMPK5/9/19/20。部分结果通过双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)在烟草体内进行了验证。通过实时荧光定量PCR技术,发现部分MKK、MPK和WRKY基因对水杨酸、草酸、核盘菌和其他逆境处理有响应。其中,WRKYa响应核盘菌侵染,为了进一步解析该转录因子基因的功能,在拟南芥中异源表达油菜WRKYa获得了转基因株系,并通过RNA干扰技术获得了拟南芥WRKYa基因的沉默株系。通过比较这些株系对核盘菌侵染的发病情况,初步探讨了WRKYa在油菜抵御核盘菌的防御反应中的作用。另外,在进行拟南芥MPK的T-DNA插入突变体的表型分析工作中,筛选到了拟南芥一个根发育比野生型拟南芥明显迟缓的突变体,命名为srk1(short root kinse1)。进一步对AtSRK1基因进行了克隆,并运用分子生物学、生物化学和遗传学等技术对其调控根发育的分子机制进行了初步探讨。
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