背景和目的：原发性肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,病死率极高。在中国,大约80%的HCC与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关。已知HBV感染的致癌作用机制包括慢性感染所致肝脏的持续炎症反应,肝细胞破坏和肝细胞代偿性增生；病毒HBx蛋白和突变的前S蛋白的直接致癌作用；以及HBVDNA整合致肝细胞基因组。虽然病毒DNA整合被认为在慢性乙型肝炎病毒肝炎感染相关的肝细胞癌的发生中有着重要作用,但现有证据主要来自对少量肝细胞癌组织的研究,且缺少大样本配对癌旁组织的研究结果。因此,开展系统性的大样本配对癌与癌旁组织HBV的整合研究十分必要。我们对60例HBV阳性肝癌患者配对的肝细胞癌与癌旁组织进行系统性的比较研究,对HBV整合在肝细胞癌中的作用进行了重新评价。材料和方法：入选病人信息：60位HCC患者来自河南省肿瘤医院(年龄30-70岁；男性：女性=42：18)。所有病例均为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性；其中57标本为HBeAg阴性,3例为HBeAg阳性；除2例为肝纤维化外,其余患者均为肝硬化背景；所有患者血清抗-HCV均为阴性；HBV C基因型。DNA提取：使用蛋白酶K消化后用酚/氯仿法提取60对配对癌组织和癌旁组织基因组DNA。QIAGEN DNA提取试剂盒提取25例患者配对的癌与癌旁组织基因组DNA,用于基于芯片技术的比较基因组杂交(array-based Comparative Genomic Hybridization, aCGH)分析。整合序列获得：使用连接接头介导的PCR (LM-PCR)和Alu-PCR方法特异性扩增HBV整合序列。LM-PCR方法使用接头特异引物和HBV特异性引物；Alu-PCR方法使用人Alu序列和HBV特异引物。HBV特异性引物包括HBV X基因区上游的引物和HBV核心基因特异性引物。对PCR产物进行直接测序,测序失败的进行克隆测序。同时采用杂交捕获结合高通量测序方法对其中28对配对的癌与癌旁组织的整合位点进行验证分析。整合序列通过NCBI Blast工具和UCSChg19数据库进行分析整合序列中的病毒和宿主基因序列。设计跨HBV X到C基因的PCR上下游引物扩增肝癌及癌旁组织中的HBV基因组。整合序列中的X基因来自于己测序证实的病毒-宿主整合序列。使用荧光定量PCR方法检测了10例整合附近的基因mRNA水平。比较基因组杂交技术(aCGH)分析染色体不稳定性。在aCGH实验中,每个癌组织标本均使用自身癌旁组织作为参照。肿瘤组织TP53基因突变分析：分4个区段PCR反应扩增全部60例患者癌及癌旁组织TP53基因的外显子2到外显子11(外显子1不能翻译氨基酸)序列。同时对扩增区域内的SNP位点进行分析,选择了9个SNP位点(rs1642785. rs17878362、rs17883323, rs1042522、rs77624624、s2909430、rs12947788.rs12951053和rs6503048)。计算肿瘤组织中杂合子基因座两等位基因峰高比值与相配对的癌旁组织对应基因座两等位基因峰高比值的比。如有2个以上的SNP位点出现峰高比值的比为<0.5或>2.0,则作为判断肿瘤组织TP53基因LOH的判定标准。使用SAS软件对实验结果进行统计学分析：统计描述采用频数表示,对完全随机下两组频数分布进行x2检验。对全基因组拷贝数变异的总数目(通过aCGH芯片得到结果)与整合的数目进行两个变量之间的相关分析。由于样本资料不符合正态分布,不适合用直线相关描述两个变量之间的相关关系,考虑用秩相关进行分析。P<0.05有统计学意义。结果：1.在癌组织和配对的癌旁组织中,整合发生的频率和在染色体分布未见差异。使用PCR方法,88%(53/60)的患者可检测到整合。68%(41/60)的肿瘤组织和72%(43/60)的癌旁组织可检测到整合。约50%(22/41)的肿瘤组织和91%(39/43)的癌旁组织可检测到多个位点的整合序列。在获得的287个整合序列中,233个位点可以精确定位到人染色体DNA上,其中81个整合序列来自癌组织,152个整合序列来自癌旁组织。其它54个序列为不能定位的序列和高度重复序列。通过杂交捕获结合高通量测序方法,在>8reads数目支持的整合序列中,癌组织共发现201个整合断点,癌旁组织共发现91个整合断点。整合的序列分布在除chr22外所有的常染色体和性染色体上。基于PCR技术的和基于杂交捕获结合高通量测序方法的整合分析均显示染色体的长度越长,整合序列数目越多。后者还发现在部分标本整合发生在线粒体DNA上。对整合位点的染色体进行细化分析,与癌旁组织相比,HBV整合位点在肝癌组织中更容易发生在脆性位点附近。在癌组织可定位的81个整合位点中,有31个位点发生在脆性位点附近；而在癌旁组织可定位的151个整合位点中,有33个位点发生在脆性位点附近。两组之间的差异具有统计学差异(x2=7.1132,P=0.0077)。下面的脆性位点被发现整合次数大于1次：5例整合发生于脆性位点FRA19B(19p13);在脆性位点FRA1A(1p36)、FRA5A(5p13)和FRA7J (7q11)位置分别发现有4个整合位点；在脆性位点FRA7B (7p22)和FRA1L (1p31)各发现有3个整合位点；在脆性位点FRA1F(1q21)、FRA12A(12q13.1)、FRA3D (3q25)、FRA6D (6q13)和FRA19A (19q13)各发现有2个整合位点。2.HBV整合易发生在富含基因的区域.在基于PCR方法得到的233个可定位整合序列中,47%(110个)的整合位点插入至细胞基因的内含子,其分布在癌组织中和癌旁组织无差异[癌组织43%(35/81)vs.癌旁组织49%(75/152)]。整合发生于基因的外显子区的有10例(4例在癌组织和6例在癌旁组织)。另外,有26个整合位点10kb之内有人基因编码序列,这其中11例发生在癌组织,15例发生在癌旁组织。基于杂交捕获结合高通量测序方法的研究发现：对>8reads数目支持的整合序列进行定位分析,28例癌组织中有28.86%(58/201)的病毒序列插入在内含子和外显子区域(其中7个序列在外显子,51个序列在内含子上),28例配对的癌旁组织中有34.07%(31/91)的病毒插入在内含子和外显子内(其中4个序列在外显子,27个序列在内含子)。其分布在癌组织和癌旁组织无差异。在60个HCC病人中,有3个癌组织在hTERT基因检测到IHBV DNA整合,而癌旁组织无一检测到此位点整合。此外,共有12个病毒插入在FN1基因附近,其中有10例发生在癌旁组织,2例发生在癌组织。3.整合序列中的病毒断点分布在配对的癌与癌旁组织未见差异对基于PCR；方法获得的287整合序列进行分析,其中163个序列含有X基因、121个序列含有病毒前C／C区,还有3个序列为前S/S基因区(既不含有X基因也不含有病毒前C/C区域)。与既往报道一致,大部分断点分布在病毒直接重复序列1(DRl)附近。本研究首次发现如此多的整合序列含有病毒前C/C区。HBV核苷酸序歹nt1601-nt1834为断裂热点,大约75%的病毒断点分布在,其中24%(68/287)的断点位于5’-CTTTTT-3’拓扑异构酶I结构域(ntl820-1825)和DRl区(nt1824-nt1834)。断点分布在DR2(nt1590-1600)的整合病毒远少于断点在DR1者。在癌组织和癌旁组织中,我们未发现病毒断点分布在两组间存在差异。4.整合序列中病毒突变在配对的癌与癌旁组织未见差异来自整合的病毒序列中C1653T、T1753V和A1762T/G1764A突变率与既往报导的的慢乙肝患者血清中HBV突变率相似,但低于肝癌和肝硬化患者；而游离HBV的突变率则与肝癌、肝硬化患者血清中的突变率相似。然而,无论是整合还是游离的HBV,C1653T、T1753V和A1762T/G1764A突变频率在配对的癌与癌旁组织中分布相近,未发现存在统计学差异。比较整合的病毒序列和游离HBV发现,C1653T和A1762T/G1764A突变率在游离组要高于整合组[C1653T,整合组vs.游离组=9%(7/75)vs.22%(15/68),x2=4.4366,P=0.0352:T1762/A1764,整合组vs.游离组=54%(31/57)vs.78%(47/60),x2=7.5434,P=0.0060].对整合中X基因序列进行分析,我们发现134个含有X基因的整合序列均为3’端缺失的x基因。在癌组织和癌旁组织未见差异。5.肝癌与癌旁组织中的整合序列附近的基因组重排整合序列中含有的前C/C区较短,不能分析整合序列中的病毒重排。我们仅对含有X基因序列的整合进行了分析。在癌组织中,25.86%(15/58)的病毒序列进行了重排,高于癌旁组织中12.26%(15/58)的病毒序列重排(x2=4.8958,p=0.0269).HBV基因的重排包括缺失、插入、扩增和倒置等多种形式,以缺失最为常见。在杂交捕获结合高通量测序方法对28对HCC标本检测结果中,癌组织和癌旁组织均发现HBV整合可多次发生在染色体某个位点几个kb左右区域,并且Reads支持数很接近,此结果提示HBV整合可能在染色体局部有一定选择性。6.未发现HBV整合与全基因组基因拷贝数异常相关。aCGH可得到全基因组水平拷贝数目的改变。对60例中的25例HCC患者进行aCGH分析(10例为女性,15例为男性),通过Spearman相关分析做整合频率与宿主全基因组水平拷贝数改变问的相关性分析,结果显示HBV整合存在与否及数目与对应肿瘤组织全基因组拷贝数变异无关。我们进一步分析了60例患者中的TP53状态。共在20个肿瘤组织中发现了21个TP53点突变。其中1个肿瘤组织含有2个点突变位点(191eu和24lys)。其中20个点突变为错义突变,导致氨基酸编码改变,1个点突变未导致氨基酸编码改变。在所有的点突变中,有10个点突变为TP53249密码子点突变(AGG突变成AGT)。从所在外显子分布看,62%(13/21)的点突变位于外显子7。外显子2、4和5分别含有2个点突,外显子8有1个点突变。而在配对的癌旁组织中,未发现有任何标本含有TP53突变。在60个HCC患者有51个可进行TP53的杂合性丢失分析,剩余9个患者的癌与癌旁组织均不含有有效的SNP信息,所以不能进行LOH分析。41%(22/51)的患者含有TP53杂合性丢失。综合考虑TP53点突变和/或杂合性丢失,我们共在48%的肝癌组织中发现有TP53异常。结合60例患者临床标本资料分析显示,未发现TP53基因状态与肝细胞癌患者性别、年龄、临床分期、AFP水平相关。我们发现抑癌基因的异常数目(包括RBI、CDKN2A、TP53、BRCA1、BRCA2和TP53BP2)与癌组织全基因组基因拷贝数变异的关系具有统计学意义(r=0.6625,P=0.0003)。7.整合附近基因表达水平选取整合位点附近明确存在人基因组编码基因(hTERT和另外9个基因)的10个配对肝癌及癌旁组织,分析病毒DNA整合对整合位点周围宿主基因表达的潜在影响。使用CTBP1作为内参基因,与配对的癌旁组织相比,这些基因在癌组织的mRNA水平改变结果如下：在肿瘤中整合附近的DNLZ、SNAPCA4和ATP8B2基因上调2倍以上,而其他6个基因的mRNA水平无改变。同时发现,在两例整合在hTERT基因启动子区的癌组织标本中,我们发现其mRNA水平上调非常明显；而在另外一例HBV整合在hTERT基因转录起始位点上游55kb处,并且病毒序列和人基因序列方向相反,该肿瘤组织中的hTERT基因mRNA水平未发生改变。结论：通过对整合序列中的病毒突变分析,我们推测HBV整合发生在疾病进程的早期。人全基因组拷贝数变异可能与抑癌基因的状态相关,而整合可能与其无关。在脆性位点附近的整合可能与肝细胞癌的发生相关。PCR方法和HBV杂交捕获结合高通量测序方法得到的整合数据显示：除脆性位点外,在染色体的分布上,整合在癌组织和癌旁组织未见明显差异；人肝癌中常见的基因组水平上的染色体不稳定性未见与HBV整合相关。约27%到47%的HBV插入在人内含子区；还有约7%的HBV插入在人外显子区域。但这些在癌与癌旁组织两组的分布未见差异。在肝细胞癌中,约48%的患者存在TP53基因异常。基于芯片技术的比较基因组杂交结果提示抑癌基因的拷贝数异常与全基因组基因拷贝数目异常相关。我们目前的数据提示在肝癌中发现的多数HBV整合与肝细胞癌的发生没有明显相关性。